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本研究利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，系统地揭示了流感A型病毒（IAV）感染人肺上皮A549细胞和人气道原代上皮细胞（hTEC）后，个体神经酰胺（C14-至C26-ceramide）亚型的特异性变化。研究首次证实，在感染条件下，细胞内的主要神经酰胺亚型C16-和C24-神经酰胺丰度发生显著“漂移”：C16-神经酰胺减少，而包括C24-神经酰胺在内的多种长链神经酰胺增加。这一发现为深入理解流感病毒感染如何扰乱神经酰胺系统提供了关键细节，并支持了靶向宿主因子以开发广谱抗流感病毒新策略的研究方向。
引言
流感是全球持续性的公共卫生问题，流感A型病毒（IAV）是导致年度流行和大流行的主要原因。由于病毒易于突变和重配，开发针对病毒本身的抗病毒药物面临耐药性挑战。因此，研究IAV与宿主的相互作用，并识别新的宿主治疗靶点至关重要。其中，靶向宿主因子是开发广谱抗流感药物的一种有前景的策略。神经酰胺是鞘脂家族的重要成员，是具有广泛细胞和宿主防御功能的生物活性脂质分子。研究表明，神经酰胺类似物可以影响IAV复制，并在病毒感染后促进树突状细胞的激活。然而，此前的研究多关注感染后总神经酰胺的变化，对个体神经酰胺亚型在感染过程中的特异性波动知之甚少。神经酰胺由鞘氨醇碱基、羟基和脂肪酸组成，所连接脂肪酸链的长度决定了其亚型（例如，含有16个碳原子脂肪酸的神经酰胺称为C16-神经酰胺）。为了更深入地研究流感病毒感染期间神经酰胺网络的变化，本研究旨在探究IAV感染过程中个体神经酰胺亚型的特异性波动。
材料与方法
细胞培养：研究使用了人肺腺癌上皮A549细胞和原代人气管上皮细胞（hTECs）。hTECs来源于拟用于移植的人肺捐赠组织的多余组织。所有细胞在37°C、5% CO2条件下培养。
病毒与感染：使用的病毒包括流感A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 和2009年大流行性流感A/CA/04/09 (H1N1)。细胞在指定的感染复数（MOI）下进行感染。
神经酰胺提取与检测：研究建立了一种利用UHPLC-MS分析来测量个体神经酰胺（C14-至C26-神经酰胺）的方法。神经酰胺的提取方案基于已有报告进行优化，并添加了内标。提取物通过Waters Acquity UHPLC coupled with a Waters Xevo TQ Absolute三重四极杆质谱仪进行分析。采用梯度洗脱，使用两个缓冲流动相和Waters Acquity C18 BEH色谱柱进行分离。通过多反应监测（MRM）模式对鞘脂和神经酰胺进行检测。C16-和C24-神经酰胺使用氘代内标（C16-d7和C24-d7）进行绝对定量，并生成了浓度范围从0.025 μg/mL到2.5 μg/mL的校准曲线。其他神经酰胺亚型则使用来自Avanti Polar Lipids的Sph/Cer I混合内标进行相对测量。数据处理和化合物定量使用了Waters TargetLynx软件包。
蛋白质印迹分析与统计分析：通过蛋白质印迹法检测IAV核蛋白（NP）和基质蛋白M1（M1）的表达。神经酰胺的相对测量值计算为每个样品中个体神经酰胺亚型的仪器响应值。使用公式：样本响应 = AreaCer/ AreaIS进行计算。为了校正内标检测的不均一性，对C20-至C26-神经酰胺样本响应值进行了调整。神经酰胺的相对丰度通过每种神经酰胺亚型的仪器响应值除以每个样本的总响应值来计算，并在每个实验组内取平均值。
结果
研究发现，在人气道呼吸道上皮细胞中，两种主要的神经酰胺亚型，C16-和C24-神经酰胺，构成了约80%的神经酰胺群体。在IAV感染后，发现在多种感染条件下，这些神经酰胺的丰度发生了转变，表现为C16-神经酰胺的减少和C24-神经酰胺的增加。具体而言，IAV感染主要导致多种长链神经酰胺的增加。这些发现为理解流感病毒感染期间神经酰胺系统如何被扰乱提供了详细信息，并进一步支持了理解流感-宿主相互作用的持续努力。
讨论与结论
本研究首次系统地描绘了IAV感染呼吸道细胞后个体神经酰胺亚型的变化图谱。研究证实了C16-和C24-神经酰胺是细胞内的主要神经酰胺，并且感染导致了它们之间平衡的“漂移”，其特点是向更长链的神经酰胺（尤其是C24-神经酰胺）积累。这种特异性变化提示，不同链长的神经酰胺可能在流感病毒感染中扮演不同的角色。例如，先前有报道称神经酰胺合酶（CerS）4（而非CerS1）会干扰流感病毒的复制，这表明由不同CerS产生的特异性神经酰胺亚型可能在流感期间具有独特功能。本研究的发现为这一观点提供了直接的脂质组学证据。神经酰胺系统，包括其他鞘脂和鞘脂代谢酶，已在体外和体内被证明在病毒感染期间传递抗病毒和促病毒特性。因此，更深入地了解鞘脂系统（包括神经酰胺网络）与病毒之间的相互作用将是有益的。本研究建立的高灵敏度UHPLC-MS/MS方法为未来研究其他病毒或病理条件下神经酰胺的个体亚型变化提供了可靠工具。总之，这项工作揭示了IAV感染诱导的特定脂质重编程事件，将长链神经酰胺（特别是C24-神经酰胺）的积累与病毒感染联系起来，为从靶向宿主脂质代谢角度开发新的抗流感治疗策略提供了新的思路和潜在靶点。
