《Biology》：Deciphering the Temporal Transcriptional Dynamics and Key Regulatory Networks of Pyrus betulifolia in Response to PEG-Induced Osmotic Stress
Ziyi Zhang,
Ke Li,
Wenxuan Chu,
Yan Zeng,
Yutong Zhu,
Ruigang Wu and
Qingjiang Wang
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本研究通过时间序列转录组学分析，系统揭示了杜梨在PEG诱导渗透胁迫下的关键响应阶段与分子机制，识别了与渗透调节、氧化应激等相关的核心通路及转录因子，为深入解析木本植物抗旱机制及抗旱育种提供了重要的候选基因资源。
引言
干旱是全球主要的非生物胁迫之一，严重制约作物生长与产量，对粮食安全和农业可持续性构成持续挑战。梨作为一种重要的温带落叶果树，其栽培常面临干旱等非生物胁迫。利用抗旱砧木是提高梨树水分利用效率和环境适应性的有效策略。杜梨作为一种具有发达根系和强抗旱性的野生砧木资源，在抗旱育种中扮演关键角色。然而，其抗旱的潜在分子机制仍有待阐明。本研究采用20% PEG-4000模拟渗透胁迫，通过时间序列RNA-seq技术，研究了杜梨叶片的分子响应，旨在系统揭示其抗旱的转录动态与调控网络。
材料与方法
研究使用杜梨组培苗，在添加20% PEG-4000的培养基中进行渗透胁迫处理，分别于0、3、6、12、24和48小时采集叶片样本。每个时间点设置三个生物学重复。提取总RNA后，进行RNA-seq测序。原始数据经质控后，比对至杜梨参考基因组。使用DESeq2进行差异表达分析，筛选标准为|log2(fold change)| ≥ 1且q值 ≤ 0.05。通过主成分分析评估样本间差异。利用Gene Ontology和KEGG数据库对差异表达基因进行功能与通路富集分析。为挖掘核心调控网络，研究采用加权基因共表达网络分析构建基因共表达模块，并识别模块内的枢纽基因。通过实时荧光定量PCR对筛选出的核心基因表达模式进行验证。
结果
转录组分析
转录组数据分析显示，各处理组内生物学重复间相关性高，主成分分析表明不同处理组样本在基因表达谱上显著分离。差异表达分析发现，与对照相比，在渗透胁迫处理3、6、12、24和48小时，叶片中分别鉴定出426、1760、1124、286和149个差异表达基因。其中，DEGs数量在6小时达到峰值，表明此阶段是胁迫响应中转录重编程的关键期。不同时间点的DEGs既有重叠又具时间特异性，共有15个基因在所有时间点均差异表达。
差异表达基因的GO与KEGG通路分析
GO功能注释将DEGs归类到生物过程、细胞组分和分子功能三个本体。随着胁迫时间延长，DEGs数量呈先增后减趋势，在6小时和12小时最活跃。此时，DEGs在三个类别中均有广泛分布，生物过程类别中以代谢过程、细胞过程、对刺激的反应和生物调控为主；分子功能类别中结合和催化活性占主导，转运蛋白活性和转录调控活性显著增强；细胞组分则主要定位在细胞、细胞器和膜上。在胁迫后期，富集的GO条目主要与代谢过程和细胞过程相关。
KEGG通路富集分析显示，氮代谢、苯丙烷生物合成和亚油酸代谢等通路在多个时间点均有富集。胁迫早期，DEGs特异富集于MAPK信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢等通路。在胁迫中期，与DNA复制、错配修复、嘧啶代谢和植物激素信号转导相关的基因表达最为活跃。在胁迫后期，富集焦点转移至淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、真核生物核糖体生物发生和内质网中的蛋白质加工等通路，表明植物后期主要通过调节碳代谢、能量供应和蛋白质稳态来适应持续的水分亏缺。
关键干旱响应共表达模块的识别与时间模式分析
通过WGCNA分析，共识别出22个共表达模块，其中三个模块表现出显著且不同的时间响应特征：MEkhaki4模块在12小时表现出特异性的瞬时诱导；MEmagenta2模块在胁迫中期维持高表达水平；而MEgreen1模块则表现出显著的后期特异性响应，在48小时达到峰值。GO富集分析揭示了各模块的功能倾向：MEgreen1模块的基因主要与膜和细胞核的组成相关，并显著富集于DNA结合转录因子活性和转录调控等核心调控类别。MEkhaki4模块独特地富集了与光合活性直接相关的条目，如叶绿体、光合作用和叶绿素结合。MEmagenta2模块则与核定位、DNA模板转录以及蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和蛋白质磷酸化等基本信号转导途径高度相关。
PEG诱导渗透胁迫下功能相关基因的时间表达特征
对与渗透调节、激素信号、ROS清除和细胞保护相关的DEGs进行分析，揭示了其不同的时间响应模式。渗透调节相关基因中，渗透脯氨酸基因在早期至中期呈轻微下降趋势，但在后期显著增加；而渗透糖基因在6-12小时显著下调，在后期迅速恢复至高表达水平。在激素信号方面，激素ABA基因在3小时迅速上调，6小时达到峰值，随后短暂下降并在24小时反弹。ROS清除基因主要在胁迫中期被显著诱导，而保护LEA基因则表现出快速的早期上调，随后是持续的波动表达。运输水基因整体呈抑制趋势，在12小时下调最为显著。
干旱响应模块中核心调控枢纽的识别
在MEgreen1、MEkhaki4和MEmagenta2模块中，大量DEGs被注释为转录因子，主要属于MYB、bZIP和C2H2家族。基于枢纽基因中心的共表达网络及其表达模式，从这三个模块中筛选出六个具有重要潜在调控作用的转录因子进行进一步分析，包括假反应调节因子5同源物、CONSTANS-LIKE 9同源物、核转录因子Y亚基C9同源物、bZIP转录因子EMBP-1同源物、CONSTANS-LIKE 6同源物以及MYB转录因子REVEILLE 1同源物。
差异表达基因的qRT-PCR验证
为验证RNA-seq数据的可靠性，对上述六个代表性核心基因进行了qRT-PCR验证。结果显示，尽管两种技术的绝对倍数变化值存在微小波动，但qRT-PCR检测到的表达趋势与RNA-seq获得的FPKM图谱高度一致，证实了测序数据的可靠性。
讨论
本研究通过多时间点的系统转录组分析，揭示了杜梨在PEG诱导渗透胁迫下存在显著的时间依赖性调控动态。DEGs数量在6小时达到峰值，表明此阶段可能是从胁迫感知到广泛转录重编程的关键过渡期。功能分析表明，杜梨主要通过协调信号转导、代谢调节和胁迫响应相关过程来应对水分亏缺。胁迫早期迅速激活MAPK信号通路，并与脯氨酸和精氨酸代谢同步，反映了植物对水分亏缺的快速感知和初级响应。进入转录活跃期后，响应机制不仅涉及广泛的激素信号转导和转录因子调控，还显著富集了DNA修复通路，表明植物在调动防御网络的同时，积极启动基因组保护机制以应对氧化胁迫可能造成的遗传损伤。胁迫后期，转录焦点逐渐转向淀粉和蔗糖代谢以及内质网中的蛋白质加工。
研究还通过时间序列WGCNA，揭示了杜梨适应干旱的明显阶段依赖性调控策略。早期特异性上调叶绿体和光合作用相关基因，表明存在一种“补偿稳定性”机制。随后，调控重点在中期转向活跃的信号转导。最终，MEgreen1模块中转录因子在48小时的广泛激活，标志着从信号处理到系统性转录重编程的关键转变，为长期生存建立了新的稳态。
结论
本研究通过深入的时间序列转录组分析，系统描绘了杜梨响应渗透胁迫的时间转录动态，识别了关键响应阶段及其特征基因。研究揭示了多个与渗透调节、氧化应激、激素信号和转录调控相关的核心通路，并通过WGCNA分析挖掘出三个与胁迫时长密切相关的共表达模块及其核心枢纽转录因子。这些发现为深入解析杜梨抗旱的分子机制提供了全面的转录组视角和宝贵的候选基因资源，为未来的功能验证研究和梨树抗旱育种奠定了重要的分子基础。
