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这篇研究性论文评估了两种用于蜱传病原体（TBP）分子筛查的CE-IVD多重实时PCR（rt-PCR）试剂盒在公民科学采集蜱虫样本中的效能。研究发现，结合市民主动提交的蜱虫，使用商业试剂盒（特别是Kit B）能有效用于蜱传病原体（如疏螺旋体、立克次体、无形体等）的区域监测和暴露风险评估，证实了公民科学在“同一健康”框架下对蜱媒病防控的实用价值。
引言
蜱是重要的人畜共患病媒介，传播包括疏螺旋体（Borreliaspp.，导致莱姆病）、立克次体（Rickettsiaspp.，导致斑点热）、无形体（Anaplasmaspp.，导致粒细胞无形体病）、埃立克体（Ehrlichiaspp.）、伯氏疏螺旋体、巴贝西虫（Babesiaspp.）以及蜱传脑炎病毒（TBEV）在内的多种病原体，对公共卫生构成重大挑战。传统的病原检测方法存在局限，而基于公民科学主动提交叮咬人体后的蜱虫，结合快速、高通量的商业分子诊断工具，为区域性的蜱及蜱传病原体（TBP）监测提供了新思路。本研究旨在评估两种CE-IVD认证的多重实时PCR试剂盒在意大利东北部一家医院收集的公民科学蜱虫样本中进行TBP分子检测的效能，并利用汇总数据描述该地区2024年的蜱种分布、发育阶段和TBP的季节性流行情况。
材料与方法
2.1. 蜱虫收集
研究在2024年4月8日至11月2日期间，于意大利维罗纳的IRCCS Sacro Cuore Don Calabria医院收集由被叮咬者自愿提交的、从人体皮肤移除的蜱虫。样本在-80°C保存直至处理，并通过问卷收集叮咬发生地的地理信息。
2.2. 蜱虫鉴定与核酸提取
在分子分析前，由医院寄生虫学实验室使用体视显微镜和分类检索表对蜱虫进行形态学鉴定至最低可能的分类等级（科或种）。同一人提交的多只蜱虫经鉴定后合并为一个样本进行后续分析。使用RNAGem?Kit通过热酶法提取蜱虫总核酸。
2.3. 使用商业CE-IVD实时PCR试剂盒检测蜱传病原体
使用两种商业CE-IVD实时PCR试剂板进行病原体检测。试剂盒A（Kit A）包含三种不同的rt-PCR反应混合液，分别检测立克次体/疏螺旋体、埃立克体/嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）和TBEV。试剂盒B（Kit B）为VIASURE蜱传疾病实时PCR检测试剂盒，包含三组混合液，分别靶向疏螺旋体/无形体/伯氏疏螺旋体（BAC）、立克次体/巴贝西虫/埃立克体（ERB）和TBEV（T）。反应在CFX96实时PCR系统上进行。为确保核酸提取有效性，额外进行了针对线粒体16S rRNA或β-肌动蛋白基因的rt-PCR作为提取过程对照。
2.4. 蜱传病原体的分子确认与物种鉴定
所有经商业试剂盒检测为阳性的样本，均送至IZSVe（威尼斯动物预防研究所）Belluno分部的野生动物中心（SWC）实验室，使用已验证的内部（in-house）分子方法进行确认和/或物种水平鉴定。疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体使用内部TaqMan实时PCR确认；TBEV使用靶向病毒RNA的TaqMan实时RT-PCR（rt-RT-PCR）检测；疏螺旋体基因种使用特异性TaqMan实时PCR区分（B. miyamotoi, B. afzelii, B. garinii, B. burgdorferi sensu stricto）；立克次体和巴贝西虫阳性样本则通过特异性终点PCR后进行Sanger测序（PCR-Seq）分析。
2.5. 统计分析
采用描述性统计。使用配对Wilcoxon符号秩检验比较试剂盒A和B在检测疏螺旋体、立克次体和嗜吞噬细胞无形体目标时，阳性样本的循环阈值（Ct）值，并计算效应大小。
结果
3.1. 收集蜱虫的特征
共收集141只个体蜱虫，合并为116个蜱虫样本进行分析。形态鉴定显示，蓖子硬蜱（Ixodes ricinus）占主导（51.7%， 73/141），最常见的发育阶段是若虫（70.9%， 100/141），其次是雌性成虫（21.3%， 30/141）。此外，还鉴定出边缘璃眼蜱（Hyalomma marginatum）和盲花蜱属（Aponommasp.）等。
3.2. CE-IVD试剂盒对蜱虫样本的TBP分子检测结果
在116个样本中，总体有33.6%（39/116）的样本至少检测到一种TBP，其中6.9%（8/116）存在共感染。两种试剂盒共同检出7个疏螺旋体阳性、16个立克次体阳性和7个埃立克体/嗜吞噬细胞无形体阳性样本。综合两种试剂盒结果，共检出疏螺旋体阳性10例、立克次体阳性19例、埃立克体（含7例嗜吞噬细胞无形体）阳性15例、巴贝西虫（Babesia microti/divergens）阳性2例。有一例样本试剂盒A检测TBEV阳性（Ct=38），试剂盒B信号微弱（Ct=45）。未检出伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）和鼠埃立克体（E. muris）。
3.3. 检出TBP的确认性检测与分子特征
通过第三方内部方法确认，在疏螺旋体属中鉴定出阿氏疏螺旋体（B. afzelii, 4例）、伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi, 2例）、嘎氏疏螺旋体（B. garinii, 2例）和宫本疏螺旋体（B. miyamotoi, 2例）。在立克次体属中，鉴定出R. helvetica（8例）、R. monacensis（6例）、R. slovaca（1例）以及4例未分型。在埃立克体组中，7例试剂盒A和B均阳性的样本被确认为嗜吞噬细胞无形体。巴贝西虫属中，一例成功鉴定为Babesia capreoli。TBEV阳性结果因洗脱液量不足未能成功确认。
3.4. CE-IVD试剂盒的统计学比较
对于疏螺旋体和立克次体目标，两种试剂盒的Ct值无统计学显著差异。但对于嗜吞噬细胞无形体目标，两种试剂盒的Ct值存在统计学显著差异（p < 0.05），且效应值非常大，表明试剂盒B对该目标的检测性能（Ct值更低）显著优于试剂盒A。
3.5. 以共感染形式传播的TBP
在39个阳性样本中，共鉴定出47种TBP，其中8个样本存在两种TBP的共感染。共鉴定出6种不同的TBP共感染组合。立克次体最常参与共感染（6/8， 75%），其次是埃立克体（4/8， 50%）。所有巴贝西虫阳性样本均以共感染形式存在（2/2， 100%）。
3.6. TBP的省份和月度分布
大部分蜱虫叮咬发生在维罗纳省（58.6%， 68/116）。在所有检出的TBP中，66%（31/47）位于维罗纳省。从月度分布看，样本提交和TBP检出高峰在5月至7月，此期间检出的病原体占总数64%（30/47）。嗜吞噬细胞无形体检出主要在4月（4/7， 57%），近半数立克次体检出在6月（9/19， 47%），而宫本疏螺旋体仅在10月和11月检出。
讨论
本研究表明，试剂盒B凭借其更广的物种覆盖范围（如可检测回归热群疏螺旋体），在共享的人类相关TBP筛查中表现更佳，但TBEV检测无法得出结论。本研究中蜱虫感染率（33.6%）较该地区2019-2022年的历史数据（约15%）有显著上升，可能反映了病原体传播增加或检测方案更优。共感染常见，巴贝西虫总是与其他病原体共感染。蓖子硬蜱若虫是主要的检出的蜱虫和传播阶段，这与蜱的生命周期及人类在春夏季户外活动增加相符。研究还检出了可传播克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）的边缘璃眼蜱，但该样本CCHFV检测为阴性。
本研究存在一定局限：两种试剂盒的检测面板不完全重叠，直接可比性有限；样本量较小限制了统计效力；基于公民自愿提交的样本可能导致地理和时间分布不均，且缺乏被叮咬者的临床数据，无法评估检出病原体的临床相关性；混合样本分析可能低估个体感染率和模糊共感染动态。
结论
本研究证实，多重CE-IVD rt-PCR检测是现实监测中检测蜱传病原体（TBP）的有效工具，其中试剂盒B因其在相同反应体系中覆盖更广的物种而展现出更优的筛查性能。分析确认了多种临床相关人兽共患病病原体的活跃传播，特别是疏螺旋体、立克次体和嗜吞噬细胞无形体，其中蓖子硬蜱若虫占主导，且在春末夏初共感染频发。将公民科学为基础的蜱虫采集与分子诊断相结合，被证明是评估人类暴露风险和监测蜱传病原体传播的季节与地理趋势的可靠方法。
