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为克服传统CAR-T疗法体外制造过程繁琐、耗时、成本高及病毒载体潜在的基因组整合风险等问题，研究人员开发了一种靶向T细胞的聚合物mRNA纳米粒（tPNP），通过递送抗CD19 CAR mRNA，成功在小鼠体内原位生成功能性CAR-T细胞，并实现了外周血和脾脏B细胞的高效清除，为简化CAR-T疗法、提高可及性提供了非病毒递送平台新策略。
在对抗B细胞恶性肿瘤的战斗中，嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR-T）疗法已展现出变革性的力量。然而，这种强大的“活体药物”在临床应用上却面临着一道高高的门槛。传统的CAR-T疗法需要从患者体内提取T细胞，在体外经过复杂的基因工程改造、长达数周的扩增培养，再回输到患者体内。这个过程不仅耗时耗力、成本高昂，而且依赖病毒载体进行基因改造，存在潜在的基因组整合风险。那么，能否绕开这些繁琐的步骤，直接在患者体内“就地”将普通的T细胞“武装”成抗癌战士呢？发表在《SCIENCE ADVANCES》上的一项研究给出了肯定的答案。研究人员开发了一种创新的可生物降解靶向聚合物mRNA纳米粒，能够直接将编码CAR的mRNA递送至体内的T细胞，成功在小鼠体内原位生成了抗CD19的CAR-T细胞，并高效清除了B细胞，为实现更安全、便捷、可及的CAR-T疗法开辟了新路径。
为了验证这一设想，研究人员运用了多项关键技术。他们首先合成了具有亲水-亲脂特性的聚(β-氨基酯)（PBAE）共聚物，该聚合物可自组装包裹mRNA形成纳米粒（NP）。通过后插入技术，在纳米粒表面引入了带有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活性基团的聚乙二醇（PEG）脂质分子。随后，将T细胞靶向配体抗CD3（aCD3）和抗CD28（aCD28）抗体共价连接至纳米粒表面，从而构建了靶向T细胞的聚合物纳米粒（tPNP）。该平台可灵活封装不同的mRNA，如荧光素酶、Cre重组酶或抗CD19 CAR的mRNA。研究使用了C57BL/6和Ai9转基因报告小鼠模型，通过静脉注射给药，利用活体成像、流式细胞术、免疫组化等方法，系统评估了纳米粒的体内分布、细胞转染特异性、T细胞激活以及最终的治疗效果（B细胞清除）。
tPNP的制备与表征
研究人员成功合成了含有80%亲脂性侧链单体的PBAE聚合物，使其能够通过疏水作用嵌入功能性的PEG-脂质。将mRNA与聚合物混合形成基础纳米粒后，再与aCD3和/或aCD28抗体反应，最终制备出粒径均匀、表面电荷近中性的tPNP。表征显示，连接抗体后纳米粒尺寸有所增大，稳定性良好，可耐受多次冻融循环甚至冻干。
tPNPs能够在体外同时激活和转染CAR T细胞
在体外实验中，与未连接抗体或仅连接aCD3的纳米粒相比，同时连接aCD3和aCD28的tPNPs能更高效地将CAR mRNA转染至原代小鼠T细胞，诱导高达44%的CAR表达。这种转染是瞬时的，表达高峰出现在处理后1天。重要的是，aCD3+aCD28 tPNPs能有效激活T细胞，上调CD25和CD69等激活标志物的表达，并诱导T细胞发生与商业化激活磁珠（Dynabeads）相当的强效增殖。与基于Moderna SM-102可电离脂质的靶向脂质纳米粒（LNP）相比，PBAE基的tPNPs在T细胞转染效率上更具优势。
tPNPs在体内展现出向脾脏转移的趋向性改变
通过静脉注射携带荧光素酶mRNA的tPNPs，活体成像分析显示，与未靶向的纳米粒相比，aCD3和aCD3+aCD28 tPNPs改变了体内分布趋向性。它们减少了在肝脏和肺部的转染信号，同时显著增强了在脾脏和多个淋巴结（如腹股沟、腋窝淋巴结）中的转染。这一结果为在富含T细胞的淋巴器官中进行靶向工程化奠定了有利基础。
tPNPs在体内展现出向T细胞转移的特异性趋向性
在Ai9报告基因小鼠模型中，注射携带Cre mRNA的tPNPs后，流式细胞术分析证实，aCD3和aCD3+aCD28 tPNPs能在脾脏和淋巴结中高效、特异地转染CD4+和CD8+T细胞，转染效率显著高于未靶向纳米粒。同时，被转染的T细胞也表现出CD25表达上调的激活状态。更重要的是，tPNPs显著降低了在脾脏和淋巴结中巨噬细胞的非特异性转染，从而实现了更高的T细胞相对于巨噬细胞的转染选择性，体现了优异的靶向能力。
通过tPNPs递送CAR mRNA可引发强效的B细胞清除
研究进入了最关键的疗效验证阶段。向健康C57BL/6小鼠静脉注射携带抗CD19 CAR mRNA的tPNPs。结果显示，aCD3和aCD3+aCD28 CAR tPNPs能诱导强烈的B细胞清除，且该效果依赖于CAR mRNA和靶向配体。在注射后12小时，外周血中CD19+B细胞的清除率就达到约60%-70%，24小时清除率峰值高达95%。在注射后36小时，脾脏中也观察到了显著的B细胞清除（aCD3+aCD28组清除约23%）。同时，治疗组小鼠血浆中检测到与CAR-T细胞杀伤相关的炎症细胞因子（如IFN-γ, TNF-α）水平升高。而使用非治疗性mRNA（荧光素酶）的对照tPNPs则未引起B细胞清除，证明了疗效的特异性。
CAR tPNP介导的治疗效果表征与优化
进一步的研究表明，单次注射aCD3+aCD28 CAR tPNPs引起的B细胞清除是瞬时的，清除率在一天后达到峰值，随后逐渐恢复，这与mRNA的瞬时表达特性一致。然而，通过多次给药（例如在第0天和第1天注射两次）可以增强并维持治疗效果，在第四天时仍能在脾脏实现约54%的深度B细胞清除。组织学切片也直观显示，经tPNP治疗的小鼠脾脏中B细胞区域显著减少。此外，多剂量的tPNPs注射在小鼠体内表现出良好的耐受性，未引起显著的长期肝毒性或体重下降，突出了该平台的可重复给药潜力。
该研究的结论与讨论部分强调了这项工作的重大意义。它成功地开发并表征了一种新型的、模块化的靶向聚合物mRNA纳米粒平台。这个平台巧妙地结合了PBAE聚合物高效递送和可生物降解的优点，以及类似LNP的PEG-脂质配体靶向策略，实现了在体内对T细胞的高选择性、高效率转染和同步激活。尤为重要的是，研究首次在淋巴结中实现了高效的T细胞靶向转染，并系统证明了该平台能显著降低在肝脏和巨噬细胞中的脱靶递送。最终，通过递送治疗性抗CD19 CAR mRNA，该平台在健康小鼠模型中展现了强大的体内B细胞清除能力，其疗效可通过重复给药得以增强和维持。这项工作不仅证实了利用非病毒载体在体内原位生成功能性CAR-T细胞的可行性，而且其纳米粒设计在选择性、疗效和可制造性方面展现出优势，为克服当前CAR-T疗法面临的制造复杂、成本高昂、可及性差等核心瓶颈提供了极具前景的解决方案，也为未来应用于肿瘤、自身免疫病等更广泛疾病领域的体内T细胞工程化治疗奠定了坚实的基础。
