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机械表征对理解软生物材料的生理功能、损伤响应及工程组织设计至关重要。本研究提出扫描激光空化流变学（sLCR）技术，通过单脉冲激光生成微空化泡并利用探针光束测量和单帧阴影成像分析，实现软水凝胶在超过10^4 s?1高应变率下的局部剪切模量空间映射，分辨率达亚毫米级，无需外源颗粒或高速摄像设备。该技术成功应用于I型胶原水凝胶，揭示浓度依赖的模量增强现象及纤维结构关联性，并界定灵敏度与空间分辨率极限。sLCR为生物力学研究提供了高应变率、空间分辨的测量平台，适用于冲击伤建模、激光手术等快速加载场景及癌症、纤维化等慢性重塑过程。
Rahul Sreedasyam|Ethan C. Vu|Shreya Thota|Elliot L. Botvinick|Vasan Venugopalan
美国加利福尼亚大学欧文分校生物医学工程系，欧文，CA 92697-2715
摘要
软生物材料的力学特性研究对于理解生物功能、损伤反应以及工程组织的设计至关重要。传统的测量技术（如平行板流变法）仅适用于低至中等机械应变率（< 10^2 s^-1）下的整体测量，对于高应变率过程的研究适用性有限。我们引入了扫描激光空化流变法（sLCR），这是一种非接触式技术，它利用单次激光产生的微空化气泡（μCBs）来测量超过10^4 s^-1应变率下软水凝胶的局部剪切模量。通过结合探针光束测量和单帧阴影成像技术，我们仅使用单次激光照射即可测量μCBs的膨胀和塌陷动态，从而无需高速摄像、外源性颗粒或重复加载即可获得剪切模量数据。我们将sLCR应用于I型胶原（T1C）水凝胶，测量了浓度依赖的剪切模量，建立了局部剪切模量与纤维结构之间的关系，并通过定义灵敏度和空间分辨率限制为该技术的应用提供了实用框架。这些结果证明了sLCR作为一种平台，在生物学相关的三维矩阵中能够提供局部化、高应变率的测量，为机械生物学、损伤建模以及复杂软生物材料的力学特性研究提供了广泛的应用价值。
重要性声明
传统的力学表征工具通常只能在低应变率下测量微观特性，或者仅提供无空间信息的整体特性数据。扫描激光空化流变法（sLCR）通过使用单次激光产生的微空化气泡，在高应变率下测量软生物材料的介观力学特性，弥补了这些方法的不足。我们展示了sLCR在测量I型胶原浓度依赖的硬化现象、关联局部弹性模量与纤维结构方面的应用，并明确了其灵敏度和分辨率限制。该方法与商用显微镜平台兼容，适合广泛推广。通过实现高应变率下的空间分辨测量，sLCR使研究人员能够研究快速加载事件（如爆炸损伤、激光手术）和慢性组织重塑（如癌症、纤维化）等现象。
引言
软生物材料的力学特性研究对于理解物理信号如何调节细胞行为和疾病进程至关重要。基础研究表明，细胞外基质（ECM）的力学特性可以影响细胞表型、细胞谱系和肿瘤进展[[1], [2], [3]]。最近的研究还发现，ECM硬度的局部差异会影响干细胞分化、纤维化和癌症侵袭[4,5]。然而，传统的体外评估ECM力学的方法通常依赖于整体流变测量或基于水凝胶浓度的推断[6,7]。尽管这些方法在宏观尺度上具有信息价值，但它们忽略了由基质结构和组成差异引起的硬度空间异质性。这种异质性日益被认为是健康和疾病过程中机械转导的关键调节因素[8,9]。
微尺度和介观尺度技术的发展，如光学相干弹性成像[10]、激光散斑流变[11]和光镊微流变[[12], [13], [14]]，为填补这一分辨率空白提供了新的途径，能够在准静态和低应变率条件下测量ECM的硬度（图1）。然而，许多临床相关事件（如创伤性脑损伤[TBI][15,16]、激光手术[17,18]和冲击波碎石[19]）会使组织承受较大的机械应变（>10^-1）和应变率（>10^4 s^-1）。目前，很少有实验方法能够在这些条件下研究软材料的力学特性。Split-Hopkinson（Kolsky）压力棒仍是高应变率力学测试的金标准，但由于其依赖于应力波传播，因此不适用于空间异质性强、波速低的生物材料[20]。
基于空化的流变技术已成为高应变率下软材料力学表征的有前景的方法，包括针诱导空化流变[21]、激光诱导膜膨胀[22]、声学空化流变[23]和激光诱导微空化方法[[24], [25], [26]]。通过生成激光诱导的空化气泡，测量其振荡动态，并将这些测量结果与理论模型进行拟合，可以估算周围材料的力学特性[24]。尽管空化流变技术代表了该领域的一项重大进步，但现有的实现方式主要局限于在单一位置提取材料特性，通常需要使用昂贵且专用的超高速摄像设备[24]。相比之下，仍需要一种能够在介观尺度上进行高应变率材料特性空间分辨测量的方法，且该方法需要适用于生物材料和机械生物学实验室的常规仪器。现有方法还存在一些重要限制，例如需要使用外源性探针或吸光颗粒[21,26]、多次空化事件才能获得单一测量结果[25]，以及与激光扫描共聚焦显微镜等共注册成像模式的兼容性问题。这些限制阻碍了空化流变技术作为软生物材料力学映射实用工具的广泛应用。
在这里，我们介绍了一种无探针、非接触式的扫描激光空化流变法（sLCR），该方法利用空化流变技术对软生物材料的高应变率剪切模量（G_HSR）进行空间映射。通过在光栅模式下生成直径约200 μm的激光诱导微空化气泡（μCBs），并测量和分析其动态，我们证明了sLCR能够在超过10^4 s^-1的应变率下获得亚毫米级（约300 μm）空间分辨率的局部G_HSR测量结果。与以往的空化流变实现方式不同，sLCR不需要高速摄像或外源性吸收剂。此外，每次测量仅需一次空化事件，且可以在商用激光扫描显微镜上实施。我们以I型胶原（T1C）水凝胶为例展示了sLCR的实用性，T1C水凝胶是一种因在天然组织中普遍存在而被广泛使用的ECM模型[27,28]。在本研究中，我们使用sLCR捕捉了T1C浓度依赖的G_HSR变化趋势，通过共注册反射共聚焦成像揭示了硬化的结构基础，并定义了该技术的灵敏度和空间分辨率限制。
实验装置
通过将频率加倍的Nd:YAG皮秒激光（EKSPLA PL2210，532 nm）的单个24 ps脉冲引入激光扫描共聚焦显微镜（Evident IX83 FV3000）的左侧端口（图2A），生成了单个微空化气泡（μCBs）。激光束被准直并导入10倍物镜（NA=0.4，Evident UPlanXApo10X）的后孔中。为了最小化边界效应，脉冲激光束的焦点体积被放置在……
T1C浓度对高应变率剪切模量的影响
sLCR应用于浓度分别为1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的T1C水凝胶。随着胶原浓度的增加，最大微空化气泡半径R_max和振荡时间T均呈单调减小（图4A-B）。这些趋势对应于剪切模量G_HSR的增加（图4C），表明在更密集的胶原基质中，材料对空化诱导变形的抵抗力更强。所有R_max、T和G_HSR的成对差异都具有统计学意义（p < 0.05）。我们的……
讨论
我们介绍了一种易于使用的非接触式方法——扫描激光空化流变法（sLCR），用于在高应变率下空间映射软材料的剪切模量G_HSR。sLCR的测量结果显示，G_HSR随T1C浓度的增加而增加（图4C），这与平行板流变法的结果一致[34]。然而，sLCR测得的高应变率剪切模量（约10-30 kPa）比准静态下的整体值高出大约三个数量级（补充材料）
结论
本研究介绍了一种非接触式技术——扫描激光空化流变法（sLCR），用于在介观尺度上对高应变率（> 10^4 s^-1）下的软材料进行力学映射。sLCR在表征快速加载事件（如爆炸损伤、碎石术、激光手术）以及T1C沉积过程中的缓慢重塑过程（如癌症、纤维化、伤口愈合）方面具有实用性。我们通过……展示了sLCR在T1C水凝胶中的应用价值
CRediT作者贡献声明
Rahul Sreedasyam：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、数据可视化、验证、软件开发、方法学设计、实验设计、数据分析、数据整理。Ethan C. Vu：数据可视化、软件开发。Shreya Thota：数据整理。Elliot L. Botvinick：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源调配、项目管理、方法学设计、资金获取、概念构思。Vasan Venugopalan：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源调配、项目管理、方法学设计
