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本研究首次报告了在雌性小鼠中建立的疼痛-重度抑郁症（MDD）共病模型。研究表明，阳性谷氨酸转运体调节剂头孢吡肟（Cefepime, CFP）能有效缓解LPS（脂多糖）诱导的雌性小鼠痛觉敏化、抑郁样行为、焦虑及认知损伤。其潜在机制涉及调节小胶质细胞反应性、上调前额叶皮质（PFC）与海马（HPC）中星形胶质细胞GLT-1表达，并降低促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平。这提示CFP可能通过靶向胶质机制和脑内谷氨酸能系统，成为治疗女性共病疼痛与MDD的潜在新策略。
1. 引言
疼痛与重度抑郁症（Major Depressive Disorder, MDD）的共病是一种普遍存在的神经精神疾病，给社会带来了沉重的经济负担，全球有超过3亿人受其影响。这种共病主要涉及调节疼痛认知和情绪方面的大脑皮层下和皮层区域的神经化学、神经胶质和形态学改变。此外，这种神经病理状况的进展和症状存在明显的性别差异，女性患者多于男性。脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的伤害性疼痛和抑郁样行为是一种成熟的动物模型，它不仅模拟了与伤害性疼痛和抑郁样行为相关的行为特征，也反映了性别对这些结果的影响。
大量证据表明，炎症通过激活胶质细胞，导致前额叶皮层（Prefrontal Cortex, PFC）和海马（Hippocampus, HPC）神经元突触处的谷氨酸能传递过度活跃。炎症介导的脑内活化小胶质细胞或外周免疫细胞释放促炎细胞因子，会损害谷氨酸的再摄取机制并促进谷氨酸释放，从而增加谷氨酸浓度。这在一定程度上是通过炎症介质下调主要表达于星形胶质细胞的兴奋性氨基酸转运体2（Excitatory Amino Acid Transporter 2, EAAT-2）或其啮齿动物同源物谷氨酸转运体1（Glutamate Transporter 1, GLT-1）的表达和功能来实现的。尸检研究也表明，抑郁症患者大脑中与谷氨酸转运体合成相关的多个基因表达减少。重要的是，在抑郁症患者的尸检研究中也检测到星形胶质细胞谷氨酸转运体的数量和功能降低。除了过度的谷氨酸能活动外，炎症介质对小胶质细胞的潜在影响可能与情绪和认知异常的发展有关，而这些异常与伤害性疼痛中发现的情况有重叠。研究表明，中枢炎症通过下调GLT-1来驱动小胶质细胞释放谷氨酸，从而抑制星形胶质细胞对谷氨酸的摄取并触发促炎细胞因子的产生。总体而言，这些发现暗示，炎症诱导的小胶质细胞激活和谷氨酸失调是共病性伤害性疼痛和抑郁症发病的主要因素。
迄今为止，已在人类中鉴定出五种EAATs，其中EAAT-2或其啮齿动物同源物GLT-1主要表达于星形胶质细胞。越来越多的文献揭示，GLT-1或EAAT-2的表达异常或功能障碍可能导致情绪相关疾病。几种药理制剂已被证明可以调节GLT-1表达，并被发现可有效治疗各种神经精神疾病。在这方面，一种实验性药物LDN-212320（LDN）和属于第三代头孢菌素的β-内酰胺类抗生素，包括头孢曲松（Ceftriaxone, CFX），已被证明可增强GLT-1表达和随后的谷氨酸再摄取，从而在神经系统疾病中发挥神经保护作用。值得注意的是，第四代头孢菌素头孢吡肟（Cefepime, CFP）在广泛的临床前模型中已显示出神经保护作用。最近，我们报道了CFP通过调节雄性小鼠的过度谷氨酸能活动来减轻LPS诱发的疼痛和抑郁。然而，CFP对LPS在雌性小鼠中诱发的疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍的影响，以及潜在的性别特异性胶质细胞机制尚未得到研究。本研究填补了当前科学文献的空白，首次报告了雌性小鼠的共病疼痛-MDD模型。
2. 材料与方法
2.1. 动物
研究使用了60只雌性C57BL/6J小鼠。所有行为研究均在光周期内进行，研究遵循良好实验室规范和ARRIVE指南。
2.2. 药物与治疗
头孢吡肟（CFP）、头孢曲松（CFX）、脂多糖（LPS）和阳性对照药物LDN均通过腹腔注射给药。选择CFP单次剂量为200 mg/kg是基于先前报告的数据。LDN和CFX被分别用作翻译和转录水平的GLT-1激活的阳性对照。
2.3. 实验设计
动物被随机分配到不同实验组，并注射LPS以诱发系统性炎症反应。治疗组小鼠在LPS注射前24小时接受LDN、CFX或CFP处理。在LPS注射后4小时和6小时分别进行机械性痛觉过敏和热痛觉过敏的行为测试。在LPS注射后24小时和26小时分别进行抑郁、焦虑和认知障碍的行为测试。为避免处理压力对行为测量的干扰，使用不同的动物队列来研究抑郁、焦虑和认知障碍。在LPS注射后28小时，处死小鼠并解剖脑组织用于进一步分析。
2.4. 行为测试
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冯弗雷测试 (Von Frey Test)：用于评估LPS注射后4小时的机械性痛觉过敏。
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热板测试 (Hot Plate Test)：用于评估LPS注射后6小时的热痛觉过敏。
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强迫游泳测试 (Forced Swim Test, FST)：用于评估LPS注射后24小时的抑郁样行为。
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悬尾测试 (Tail Suspension Test, TST)：用于评估LPS注射后24小时的抑郁样行为。
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高架十字迷宫测试 (Elevated Plus Maze Test, EPM)：用于评估LPS注射后26小时的焦虑样行为。
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Y迷宫测试 (Y-maze Test)：用于评估LPS注射后26小时与工作记忆相关的认知功能。
2.5. 蛋白质印迹分析 (Western Blot Analysis)
采用蛋白质印迹法检测海马（HPC）和前额叶皮层（PFC）中GLT-1和小胶质细胞标记物离子钙结合适配分子1 (Ionized calcium-binding adaptor molecule 1, Iba-1) 的蛋白水平。
2.6. 酶联免疫吸附试验 (ELISA)
采用ELISA法测定海马和前额叶皮层中肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α) 和白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β) 的浓度。
2.7. 统计分析
采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey事后检验分析正态分布数据。采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验分析非正态分布的行为数据。p < 0.05被认为具有统计学显著性。
3. 结果
3.1. CFP对LPS注射雌性小鼠伤害性行为的影响
与对照组相比，LPS处理显著降低了机械刺激阈值和热板撤足潜伏期，表明产生了机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。而CFP预处理显著逆转了LPS诱导的机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。阳性对照药物LDN和CFX也表现出类似的镇痛效果。
3.2. CFP对LPS注射雌性小鼠抑郁样行为的影响
LPS注射显著增加了小鼠在强迫游泳测试和悬尾测试中的不动时间，表明产生了抑郁样行为。CFP预处理显著减少了这两种测试中的不动时间，显示出抗抑郁效果。LDN和CFX预处理也显著减少了不动时间。
3.3. CFP对LPS注射雌性小鼠焦虑和认知障碍的影响
LPS处理显著减少了小鼠在高架十字迷宫中的开臂停留时间和在Y迷宫中的自发交替率，表明产生了焦虑样行为和认知缺陷。CFP预处理显著逆转了LPS诱导的开臂停留时间减少和自发交替率降低，显示出抗焦虑和促认知作用。LDN和CFX预处理也产生了类似的效果。
3.4. CFP对HPC和PFC中GLT-1蛋白水平的影响
与对照组相比，LPS显著降低了海马和前额叶皮层中GLT-1的蛋白水平。CFP预处理显著逆转了LPS引起的GLT-1蛋白水平下降。LDN和CFX预处理也显著上调了GLT-1的蛋白表达。
3.5. CFP对HPC和PFC中Iba-1蛋白水平的影响
LPS处理显著增加了海马和前额叶皮层中小胶质细胞标记物Iba-1的蛋白水平，表明小胶质细胞被激活。CFP预处理显著降低了LPS诱导的Iba-1蛋白水平升高。LDN和CFX预处理也显著抑制了Iba-1的表达。
3.6. CFP对HPC和PFC中TNF-α和IL-1β产生的影响
LPS注射显著增加了海马和前额叶皮层中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。CFP预处理显著抑制了LPS诱导的TNF-α和IL-1β的产生。LDN和CFX预处理也显著降低了这两种细胞因子的水平。
4. 讨论
本研究观察到，全身性给予CFP可有效减轻LPS注射雌性小鼠的机械性痛觉过敏、热痛觉过敏、抑郁相关焦虑和认知障碍。研究发现，CFP的系统给药显著调节了LPS处理雌性小鼠的谷氨酸转运体蛋白水平，表现为海马和前额叶皮层中GLT-1表达增加。此外，腹腔注射CFP显著逆转了LPS诱导的Iba-1表达升高，表明其减轻了调节疼痛认知和情绪方面的脑区（海马和前额叶皮层）中的小胶质细胞反应性和随后的促炎细胞因子释放。海马和前额叶皮层中IL-1β和TNF-α的减少很可能是由小胶质细胞激活减少驱动的，这与LPS诱导强烈小胶质细胞反应的证据一致。越来越多的研究报道，系统性LPS诱发的大脑促炎细胞因子信号传导会导致啮齿动物的疼痛敏化和抑郁样行为。此外，促炎细胞因子已被证明会降低星形胶质细胞谷氨酸转运体的表达，导致谷氨酸再摄取减少。研究数据表明，LPS诱发的神经炎症（以IL-1β和TNF-α升高为标志）导致海马和前额叶皮层中GLT-1蛋白水平降低。据所知，这项研究首次在雌性小鼠的共病疼痛-MDD模型中提供了证据。
研究发现，腹腔注射LPS会触发边缘脑区的神经炎症，这有助于雌性小鼠伤害性疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍的发展。大量证据支持包括海马和前额叶皮层在内的多个大脑区域参与啮齿动物和人类的焦虑和抑郁相关表型。此外，疼痛状态下的抑郁、焦虑和认知异常被认为是与疼痛相关的残疾。已知炎症信号与大脑信号模式的变化有关，从而引发抑郁、焦虑和认知缺陷样行为。
研究发现，腹腔注射LPS会导致雌性小鼠海马和前额叶皮层区域的小胶质细胞激活和随后炎症介质的释放，而CFP的全身治疗可以预防这一过程。先前的研究报告称，人类注射LPS会导致系统性促炎细胞因子增加，并由于免疫到大脑的通讯而产生伤害性痛觉过敏和抑郁样行为，这已在雄性啮齿动物模型中进行了广泛研究。此外，先前曾报道CFP通过调节雄性小鼠的小胶质细胞反应性和过度谷氨酸能神经传递来减轻LPS诱发的疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍。本研究发现在雌性小鼠中，系统性LPS给药会导致机械性痛觉过敏、热痛觉过敏、抑郁相关焦虑和认知障碍，并与海马和前额叶皮层中小胶质细胞激活和细胞因子产生增加相关。与先前研究一致，这些发现表明，单次LPS注射24小时后，小胶质细胞被激活，随后边缘脑区促炎细胞因子的产生增加。最近的研究表明，LPS会上调炎症细胞因子的表达，并在雄性和雌性啮齿动物模型中引起抑郁样行为。先前的研究也记录到，失调的小胶质细胞激活深刻促进了共病疼痛和抑郁症的发病机制。然而，不能排除炎症介质也损害了至关重要的星形胶质细胞稳态功能的可能性。虽然本研究未调查星形胶质细胞是否被激活并产生促炎细胞因子，从而加剧海马和前额叶皮层的神经炎症，但先前的发现强烈表明，星形胶质细胞增生是小胶质细胞激活的下游效应。由于小胶质细胞因其广泛的Toll样受体（Toll-like Receptors, TLRs）而对LPS暴露高度敏感，而星形胶质细胞表达这些受体的程度最低，导致对LPS的反应性较低。这凸显了小胶质细胞在触发星形胶质细胞反应中的关键作用。
结果表明，CFP预处理显著逆转了雌性小鼠海马和前额叶皮层中LPS降低的GLT-1蛋白水平。与研究发现一致，神经炎症已被证明可通过下调星形胶质细胞GLT-1并随后抑制谷氨酸摄取来触发小胶质细胞释放谷氨酸，导致细胞因子释放增加。有趣的是，有证据表明，与GLT-1功能降低相关的过度谷氨酸能神经传递参与了伤害性疼痛和抑郁样行为的发病机制。越来越多的证据表明，失调的胶质细胞功能会导致参与疼痛调节和情绪调节的大脑区域（海马和前额叶皮层）内的神经解剖学和神经化学异常。重要的是，EAAT-2/GLT-1通过维持低细胞外谷氨酸浓度，是兴奋性神经传递的主要调节因子。此外，Hu等人报道，通过系统性CFX治疗上调GLT-1可预防炎症小鼠模型中的痛觉过敏。同样，最近的一项研究表明，CFX通过调节GLT-1表达来减轻大鼠乙醇戒断期间的焦虑和抑郁样行为。先前，一项研究发现女性抑郁症患者背外侧前额叶皮层中EAATs基因的表达更高，但男性则没有。此外，在卒中相关脑损伤期间，注射LDN的雌性小鼠小脑中未观察到GLT-1表达上调。因此，疾病模型严重程度的高度可变性解释了GLT-1在不同大脑区域的性别特异性调节。此外，研究发现LPS诱导的海马和前额叶皮层GLT-1下调与炎症细胞因子产生增加有关，表明这种谷氨酸转运体失调驱动了疼痛、情绪障碍和认知缺陷。
先前已证明CFP以剂量依赖的方式减轻雄性小鼠中LPS诱发的疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍。因此，在本研究中使用了CFP（200 mg/kg）进行行为和生化/分子分析。值得注意的是，已记录CFP在治疗剂量下是安全有效的，并且已经讨论了最近关于CFP与其神经保护作用相关的发现。此外，先前评估了CFP单独对LPS诱发的疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍的影响。也报道了GLT-1抑制剂二氢海人酸（dihydrokainic acid）消除了CFP的神经保护作用，表明星形胶质细胞GLT-1在产生这些效应中起着关键作用。同样，先前的研究表明，单独全身给予CFP（200 mg/kg）可在转录水平上增加海马和前额叶皮层的GLT-1表达。
大量证据表明，在各种疼痛和抑郁动物模型中，海马和前额叶皮层的谷氨酸转运体表达在转录和翻译水平上均失调。在这方面，谷氨酸转运体可以通过增加其mRNA表达（转录）和/或增加其蛋白水平（翻译）来进行药理学调节。GLT-1的多种调节机制为涉及增强谷氨酸能神经传递的神经炎症状况提供了多种治疗途径。因此，包括转录激活剂CFX和翻译激活剂LDN在内的几种GLT-1激活剂已被证明可在多种神经和精神疾病中提供神经保护。应注意，转录激活剂诱导GLT-1 mRNA的持续增加，导致GLT-1表达的长期上调。相反，通常需要重复给予GLT-1翻译激活剂才能实现谷氨酸转运体表达的长期增加。在此背景下，CFP诱导GLT-1的转录上调，从而提供了一种增加长期谷氨酸转运体表达和功能的持续机制。
本研究存在三个主要局限性，可在未来研究中解决。首先，该研究检测了CFP在急性炎症模型中的作用。其次，尽管数据证明了显著的星形胶质细胞GLT-1调节，但介导这一过程的特定细胞、分子和区域特异性机制，特别是在疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍的背景下，尚未完全明了。第三，本研究独立分析了不同性别，而非测试性别与治疗的交互作用。未来的研究应调查CFP对LPS诱发的慢性疼痛、抑郁相关焦虑和认知障碍的影响，重点关注性别差异和其他大脑区域。此外，为了确保准确报告性别差异，未来的研究应使用混合性别队列，并测试性别和治疗之间的交互作用。
5. 结论
研究结果提供了令人信服的证据，表明阳性谷氨酸转运体调节剂CFP可减轻LPS诱导的雌性小鼠机械性痛觉过敏、热痛觉过敏、抑郁相关焦虑和认知障碍。这些效应很可能是通过调节海马和前额叶皮层中的小胶质细胞反应性和过度谷氨酸能神经传递介导的。
