《Applied and Environmental Microbiology》：Molecular typing of Mycoplasma synoviae in industrial and backyard poultry: a 14-year study in Italy
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本综述通过对意大利北部高密度家禽养殖区长达14年的禽滑液支原体（M. synoviae）分子分型研究，系统揭示了该病原的遗传多样性、传播模式与进化动态。研究发现病原传播主要由集约化生产网络（共享物流、人员）驱动，而非地理邻近或散养场交叉传播。研究强调了多基因座序列分型（MLST）在追踪公司层面疫情暴发中的价值，为全球一体化生产网络的病原防控提供了关键见解。
引言：集约化生产与病原传播风险
家禽病原（如支原体）的发生和持续与集约化家禽生产系统密切相关，后者增加了暴露和传播的风险。意大利北部存在一个高密度家禽养殖区，在狭小的地理区域内集中了大量集约化家禽养殖场和散养场，这为观察家禽病原动态提供了一个有趣的研究案例。该地区家禽养殖主要以鸡和火鸡为主，但也可见珠鸡、雉鸡、鹧鸪、鸭和鹅。此外，高密度家禽养殖区的集约化养殖通常采用一体化系统，即所有生产阶段由少数几家公司管理。这些公司通常在跨区域经营多个农场，有时相隔很远，但共享运输、人员和污染物，这些都可能导致病原体传播。集约化系统依赖于有限的商业品种，而散养农场则是小规模、低密度（通常少于50只家禽）的，由私人经营，家禽品种多样，与集约化环境中的品种不同，反映了更广泛的主机遗传背景。
禽滑液支原体是集约化家禽产业中造成重大经济损失的重要细菌种类，可导致气囊炎和传染性滑膜炎，并与蛋壳顶端异常相关，从而造成蛋鸡生产损失。禽滑液支原体可在同一鸡群内个体间或不同鸡群间垂直和水平传播。控制其传播涉及生物安全措施、疫苗接种、抗生素治疗以及使用分子标记、血清学技术和菌株分型的控制程序。然而，这些措施通常仅应用于集约化部门，而不用于散养场。因此，在同一区域内，感染散养场与集约化农场并存可能会影响禽滑液支原体在两个部门间的传播。鉴于以上原因，对流行野外菌株进行遗传鉴定是追踪禽滑液支原体传播的有效工具。
研究背景与方法
禽滑液支原体菌株的主要分子鉴定技术是多基因座序列分型，可用于推断野外菌株的克隆性和进化相关性。该方法由El-Gazzar等人开发，使用七个管家基因（adk, atpG, efp, gmk, nagC, ppa, recA），共覆盖约3,959个碱基对；每个等位基因谱及其组合定义了序列型。该方法可通过PubMLST等全球网络数据库轻松访问，实现ST和菌株信息的免费共享，有助于识别全球分布模式以及各国的独特等位基因组合。MLST以其易用性、可扩展性和可靠性而广受认可。本研究首次将MLST应用于特定环境（如公司、单一实体农场和散养场）中长期追踪禽滑液支原体传播。研究应用MLST方法对14年间（2010-2024年）从不同意大利地区收集的181个集约化和46个散养野外菌株进行分型。多数样本来自鸡和火鸡，这反映了意大利家禽养殖的结构。研究旨在通过识别随时间的ST分布，并追踪其在同一公司旗下农场之间、以及单一实体与散养家禽农场之间的地理传播，来调查禽滑液支原体暴发。研究在地区层面以及集约化和散养层面检查了感染鸡群中ST的分布，并分析了意大利ST的遗传多样性和全球背景。此外，还分析了意大利菌株的遗传变异和进化关系，并将其与从PubMLST获得的不同国家的数据进行比较。
样本收集与分型
研究分析了2010年至2024年6月期间从鸡、火鸡、珠鸡、鹧鸪、鹅和雉鸡收集的227个意大利禽滑液支原体样本。超过80%的样本来自集约化家禽来源，其余来自散养农场。样本主要来自意大利北部地区。约90%的散养场样本在2010年至2021年间收集于威尼托地区。由于威尼托地区包含了大部分散养家禽样本，因此被选为重点比较区域，以评估散养和集约化部门之间可能的流行病学联系。集约化样本主要来自三家大公司（标记为A、B、C），其余来自不同的次要集约化家禽农场（称为D）。本研究覆盖的区域在很大程度上与意大利北部指定的家禽生产区重叠，该区域占意大利集约化饲养家禽的近70%。
研究采用世界动物卫生组织（WOAH）方法进行病原分离，并使用MLST进行分型。对七个管家基因进行扩增和测序，并将新的等位基因和ST提交至PubMLST数据库。通过计算辛普森多样性指数评估遗传多样性，使用最小生成树和最大似然法构建系统发育树分析菌株关系，并利用Arlequin软件计算遗传多样性指标（如单倍型数量、核苷酸多样性、分离位点、Tajima's D和固定指数FST）来比较意大利、中国和美国种群。
研究结果
意大利禽滑液支原体的MLST分析与传播模式
研究将227个分离株分为99个ST，辛普森多样性指数为0.96，表明多样性程度很高。其中鉴定出95个新ST。所有分离株分为12个克隆复合体，有41个分离株为单例。大多数分离株无论来自哪个部门或地区，都聚集在相同的克隆复合体中。例如，在克隆复合体CC1中，ST60、ST71、ST85和ST133被来自不同地区的多个散养和集约化分离株共享。然而，来自同一部门的一些分离株也聚集在特定的克隆复合体中：CC7和CC9中仅发现散养样本，而CC12仅包含集约化样本。
多年来最常见的ST是ST21、ST71、ST63和ST133，它们在不同部门间共享。ST21主要在2012-2014年期间收集，之后逐渐消失，自2021年后未再分离到。ST71主要在2015-2016年发现，随后仅在集约化部门持续存在至2023年。ST133最初在散养环境中占优势，后来在集约化系统中稳定下来。大多数ST在14年间仅由一个分离株代表，尽管其中一些菌株是在多年前收集的，但并未重新出现。相反，有32个ST在多个分离株间共享，一些ST仅出现在特定部门。此外，观察到一些ST存在于多种宿主物种中，表明某些ST可以在不同宿主间传播。
意大利公司内禽滑液支原体随时间和跨区域的传播
MLST分析表明，同一ST有时会在同一公司内部的不同农场发现。例如，ST21于2019年从艾米利亚-罗马涅大区的公司A的三个不同农场分离到；ST186于2022年从公司B的两个农场分离到；ST133于2016年从公司C在北部其他地区的两个农场分离到。相反，相同的ST也在同一公司内相距遥远的农场中发现。例如，ST162于2021年从公司B拥有的、位于远离高密度家禽养殖区的两个大区的三个农场分离到。同样，ST71于2018年在意大利北部的公司C的三个农场中发现。同一个ST可以在不同年份、有时是连续年份中重新观察到，有时在同一公司内，有时在不同公司之间，这表明菌株在集约化部门具有持久性。显著的例子包括ST21、ST71、ST113、ST122、ST143和ST144，它们在不同年份和公司中被鉴定出来；以及ST74、ST141和ST150，它们在多年间在同一公司中被检测到。
威尼托地区收集的散养家禽农场
在分析的ST中，有19个为散养样本独有，16个为集约化样本独有，9个由两个部门共享。在某些情况下，如ST21、ST72、ST122和ST139，集约化和散养农场在同一年携带相同的ST，表明同一禽滑液支原体菌株在该地区持续存在。然而，所有其他ST在同一年未在两个部门间共享，表明相互作用有限。
系统发育与遗传分析
基于MLST序列构建的最大似然树显示，大多数ST按国家聚类，呈现国家特异性趋势，但存在例外。例如，ST21分布最广，其次是ST10和ST57。有趣的是，意大利ST与其他欧洲及中东分离株聚类。不同宿主物种的ST并未形成独立的簇，表明宿主物种不影响系统发育树的结构。
遗传分析聚焦于意大利、中国和美国，这些国家是PubMLST中上传分离株最多的国家。意大利样本在所有位点均含有新的等位基因，而中国菌株的独特等位基因数量较低，特别是在efp、atpG和ppa基因。总体而言，美国和意大利显示出更高的私有等位基因计数。nagC基因在所有种群中表现出最多的分离位点，而efp基因的等位基因计数和分离位点最低。对于串联基因，意大利具有最多的独特ST，而中国最少。平均成对核苷酸差异也遵循相同顺序：美国最高，意大利居中，中国最低。这些差异可能反映了不同的人口历史：美国的高多样性可能源于其较长的采样时期和稳定种群，而中国的低多样性可能表明近期存在瓶颈或奠基者效应。
Tajima's D值显示，所有国家串联基因的Tajima's D均为负值，表明存在过量稀有等位基因，可能意味着种群扩张或纯化选择。中国偏离最强，其次是意大利和美国。基因特异的Tajima's D值各异；值得注意的是，ppa基因的正Tajima's D值表明存在过量中等频率多态性，可能意味着平衡选择、近期种群瓶颈或两者兼有。固定指数FST值显示，ppa、efp和atpG基因的种群分化程度最高。对于串联基因，FST为0.47，支持中等至高度的种群结构，即不同地理区域分离株之间存在遗传细分，反映了它们之间有限的基因流动。
讨论
本研究首次尝试评估意大利集约化农场内部以及集约化与散养家禽农场之间禽滑液支原体的遗传多样性。研究发现禽滑液支原体遗传多样性水平很高，鉴定出99个不同的ST，其中95个仅在意大利发现。这与先前强调支原体物种遗传变异的研究一致。高数量的单次分离ST可能是生物安全措施（如自2012年起在意大利实施的禽滑液支原体疫苗接种）和/或抗生素使用的结果，可能限制了菌株传播。同时，某些ST的零星检测可能反映了菌株特异性的致病性差异。
样本被分为12个克隆复合体，跨越不同的地理区域和产业部门。无论其地理来源如何，属于同一克隆复合体的样本通常来自不同的地区，表明禽滑液支原体菌株与其分离区域之间没有明确的相关性。相反，来自主要家禽公司的分离株显示，尽管地理分布广泛，但相同的ST在农场间传播。此外，对ST复发的时间分析表明，某些疫情暴发与相同的ST相关。尽管有生物安全措施，公司间共享ST表明，禽滑液支原体传播主要由一体化生产系统的物流驱动，促进了相同ST在农场间的传播，而非受地理邻近性影响。这些发现与之前对其他家禽病原体的观察结果一致。
先前假设认为散养家禽群可作为呼吸道疾病的储存库或放大器。然而，研究数据表明，在威尼托地区，两个部门之间的传播有限。事实上，仅9个ST在两个部门间共享。其中，ST21分布最广，而ST139仅在2013年出现。ST122于2017年首次在两个部门检测到，但随后仅在集约化农场持续存在。ST60、ST63、ST71和ST72最初出现在集约化部门，短暂出现在散养鸡群中，然后在集约化系统中重新建立，表明从商业化到散养生产存在零星的溢出。一个例外情况是ST133，首次在农村鸡群中发现，随后在集约化系统中稳定下来，意味着从散养到集约化部门存在罕见的交叉污染。尽管如此，许多ST为一个部门独有且在同一年不重叠，这意味着这两种家禽养殖类型在很大程度上是独立的储存库。
系统发育树显示，意大利禽滑液支原体分离株表现出明显的地理特异性，正如先前基于MLST的系统发育所观察到的那样。然而，观察到来自其他欧洲国家以及中东的分离株与意大利菌株聚类。这种某些ST的全球共享模式凸显了通过家禽和产品贸易进行禽滑液支原体国际传播的可能性。例如，ST21在意大利、匈牙利、塞尔维亚、突尼斯、乌克兰和俄罗斯被鉴定出来，表明可能存在商业交流。另一个例子是ST10，1997年首次在美国报道，随后在不同国家被发现直至2016年，在意大利也曾于2012年发现一次。先前研究认为，洲际交流可能是由于携带支原体的野生鸟类迁徙所致。然而，需要更多研究来确认和阐明候鸟在这一传播途径中的作用。此外，不能排除商业交流作为促成因素的可能性，应在未来调查中予以考虑。
在PubMLST中数量最多的国家是美国、中国和意大利，它们单独聚类。意大利具有最多的独特ST，而中国最少，表明存在不同的进化压力。与意大利和美国相比，中国在所有基因中的等位基因数量都较低。中国atpG、efp和ppa基因的变异性最低。在意大利，efp和ppa基因的变异性最低，但与中国不同，gmk基因并非最低。遗传多样性在不同国家间存在差异：意大利显示出中等多样性，可能反映了过去的人口动态。美国具有较高的多样性值，可能是由于长期的地方性多样性或多重引入。中国的低值表明其种群结构可能更倾向于克隆性。这种国家特异性变异可能反映了环境压力、养殖实践、品种遗传和家禽流动网络的差异。
Tajima's D值揭示了作用于三个国家禽滑液支原体种群的不同进化压力。所有国家均显示负值，表明近期种群扩张或普遍的纯化选择。中国的强烈负值支持了近期扩张的假设，可能与禽滑液支原体较晚引入中国有关。反过来，过去十年亚洲家禽生产的快速增长可能促进了这种扩张。相比之下，意大利更温和的负值可能符合更长的纯化选择历史，近期人口变化较少，这可能与意大利一体化系统中的品种类型、养殖系统、生物安全措施和家禽密度等多种因素组合一致；然而，农场间的种群亚结构也可能促成这一信号。分析表明，意大利禽滑液支原体种群在遗传上可能与中国和美国种群不同，表明其进化轨迹因当地的养殖实践和宿主-病原体动态而不同。
此外，在七个管家基因中，nagC和ppa具有双重代谢作用。nagC参与唾液酸分解代谢和宿主适应，而ppa参与营养应激期间的能量稳态。因此，这两个位点可能受到生态位特异性选择压力的影响，这反映在它们的多样性指标中。nagC显示出高变异。同时，ppa显示出最强的种群分化，并且三个国家之间的Tajima's D值差异极大。相比之下，严格的管家基因，如gmk和adk，显示出较低的多样性和一致的负Tajima's D值，表明主要的纯化选择。它们的低多样性和负Tajima's D值可能反映了功能限制而非简单的人口历史。为了更清晰地区分人口与选择信号，建议纳入额外的假定中性标记。
结论
总之，本研究表明，在意大利，禽滑液支原体传播主要由产业化生产网络驱动，而非地理邻近性。高遗传多样性反映了进化过程与农场层面生物安全实践之间的平衡，仅有零星从散养鸡群到一体化生产的溢出。这些发现强调，需要针对垂直一体化家禽系统（通常称为高密度家禽养殖区）量身定制监测计划，尤其是在全球对禽肉需求持续推动大规模、高密度生产模式扩张的背景下。在这些网络内进行针对性监测对于禽滑液支原体暴发的早期检测和控制至关重要，同时也有助于通过改进疾病管理、减少对抗生素的依赖来提升生产效率、促进更可持续的实践，并最终降低耐药性发展的风险。
