猪支气管败血波氏杆菌皮肤坏死毒素在单一感染及与猪链球菌共感染中对猪呼吸道上皮细胞影响的体外研究

本文聚焦猪呼吸道重要病原体猪支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）的皮肤坏死毒素（DNT），探究其在体外模型中（空气-液界面培养物ALI和精密肺切片PCLS）对猪呼吸道上皮细胞的影响。研究发现，DNT既不参与细菌的细胞毒性作用与定植，也未在促进与猪链球菌（Streptococcus suis）的共感染中发挥作用，但对促炎细胞因子反应的调控具有独立于DNT的增强效应，为理解呼吸道共感染机制提供了新见解。

　　

引言与研究背景

猪支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）是一种与百日咳鲍特菌（B. pertussis）密切相关的革兰氏阴性杆菌，可在多种动物（包括猪）中引起呼吸道感染，是猪非进行性萎缩性鼻炎（atrophic rhinitis）的病原体之一，并参与猪呼吸道疾病复合体（Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC）。皮肤坏死毒素（Dermonecrotic Toxin, DNT）作为一种胞质热不稳定毒素，属于细胞毒性坏死因子家族，已知可通过激活小GTP结合蛋白Rho等导致细胞骨架发生巨大形态学改变，并抑制成骨细胞分化，从而在萎缩性鼻炎中导致鼻甲骨破坏。然而，关于DNT对呼吸道上皮细胞的作用所知甚少。同时，作为PRDC的一部分，B. bronchiseptica可为继发性病原体（如猪链球菌 Streptococcus suis）的感染铺平道路，但其具体机制，尤其是DNT在其中扮演的角色，尚不明确。

材料与方法

本研究使用了两套高度模拟体内猪呼吸道上皮的体外模型：在空气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）条件下分化的猪呼吸道上皮细胞（ALI培养物）以及猪精密肺切片（Porcine Precision-Cut Lung Slices, PCLS）。ALI培养物可形成屏障并评估其完整性，而PCLS则保留了原始组织架构、功能、常驻免疫细胞及其他细胞类型。

使用的菌株包括：DNT阳性的B. bronchiseptica野生型（WT）菌株KM22，及其同基因的DNT缺陷突变株（Δdnt, KM24）；以及用于共感染实验的猪链球菌血清型2野生型菌株10（S. suis10）。

实验流程为：先用B. bronchisepticaWT或Δdnt感染ALI培养物或PCLS 24小时，然后进行S. suis的共感染，感染总时长最长达72小时。在不同时间点（例如共感染后4小时t₄、24小时t₂₄、48小时t₄₈）进行采样评估。

评估指标包括：细菌生长与定植（通过菌落形成单位CFU计数）、细胞毒性（通过乳酸脱氢酶LDH释放测定）、上皮屏障完整性（通过跨上皮电阻TEER测量）、纤毛活动性（PCLS中通过光学显微镜监测）以及宿主促炎细胞因子反应（通过逆转录定量实时PCR (RT-qPCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 分析IL-1α, IL-6, CXCL8, TNF-α等）。

结果

DNT表达及其受体在猪呼吸道模型中的表达

RT-qPCR证实，在野生型B. bronchiseptica中dnt基因表达上调，而在Δdnt突变株中表达下调。通过RT-PCR检测发现，DNT的预测受体——T型电压门控钙通道Ca_V3.1 (CACNA1G) 在ALI培养物和PCLS中均有表达，而Ca_V3.2 (CACNA1H) 仅在PCLS中表达，表明两种模型均适合研究DNT的作用。

细菌对猪呼吸道上皮的定植

无论是ALI培养物还是PCLS，B. bronchisepticaWT和Δdnt突变株的细胞/组织相关细菌数量随时间增加，且两者之间无显著差异，表明DNT不影响B. bronchiseptica的定植能力。在共感染情况下，B. bronchiseptica的定植数量略有减少，而S. suis的定植在早期（t₄, t₂₄）因预感染了B. bronchiseptica（无论WT或Δdnt）而显著增强。

免疫荧光分析证实，B. bronchiseptica主要粘附在纤毛上，而S. suis主要存在于肺泡上皮。在共感染后期，纤毛结构遭到破坏。

对猪呼吸道上皮的细胞毒性作用

在ALI培养物中，B. bronchiseptica感染导致LDH释放随时间增加，但WT与Δdnt菌株间无差异。S. suis单感染在早期（t₄）诱导较高的LDH释放，而在共感染时，特别是在t₂₄，细胞毒性表现出协同增强效应。TEER测量显示，B. bronchiseptica感染导致上皮屏障完整性呈时间依赖性破坏，而共感染则造成更严重的屏障崩溃。

在PCLS中，B. bronchiseptica单感染仅诱导低水平的LDH释放，但能显著降低纤毛活动性（导致纤毛停滞），而S. suis单感染对纤毛活动性影响甚微。然而，两种病原体共感染在早期（t₄和t₂₄）导致了协同的细胞毒性作用（LDH释放显著增加）。附加实验表明，只有完整的细菌培养物，而非无细胞的（热灭活）上清液，能够诱导细胞毒性和纤毛活动性降低。

感染后的细胞因子反应

促炎细胞因子（IL-1α, IL-6, CXCL8, TNF-α）的反应模式在两个模型中有所不同。在ALI培养物（主要为上皮细胞）中，细胞因子（尤其是CXCL8）的表达主要在B. bronchiseptica感染后被诱导，而S. suis单感染诱导作用很弱。在感染后期（t₄₈），共感染导致某些细胞因子（如IL-1α, CXCL8）的水平高于单感染。

在包含多种细胞类型（包括免疫细胞）的PCLS中，早期感染（t₄）的细胞因子表达在共感染时增强。在t₂₄，IL-1α, IL-6, TNF-α的表达主要被S. suis诱导，而CXCL8主要被B. bronchiseptica诱导。ELISA检测细胞因子蛋白水平与基因表达趋势基本一致，其中CXCL8的蛋白水平在B. bronchiseptica感染时最高，而在共感染或S. suis单感染后期降低，可能与S. suis的丝氨酸蛋白酶对CXCL8的切割有关。

关键的是，在所有细胞因子反应分析中，B. bronchisepticaWT与Δdnt突变株之间均未发现显著差异，表明DNT不参与调控这些促炎细胞因子的反应。

结论

本研究首次在模拟猪呼吸道的两种体外模型（ALI培养物和PCLS）中，系统评估了DNT在B. bronchiseptica单一感染及其与S. suis共感染中的作用。主要结论如下：

1. 1.
   DNT不参与B. bronchiseptica对猪呼吸道上皮的定植过程，野生型与DNT缺陷突变株的定植能力无差异。
2. 2.
   DNT不贡献于B. bronchiseptica对呼吸道上皮细胞的细胞毒性作用，也不影响其破坏上皮屏障完整性及导致纤毛停滞的能力。
3. 3.
   预感染B. bronchiseptica（无论是否产DNT）能够促进S. suis在呼吸道上皮的早期定植，但DNT本身并不介导或促进这一共感染过程。
4. 4.
   B. bronchiseptica感染可诱导早期的促炎细胞因子反应，而S. suis感染诱导的细胞因子反应较晚且较弱。两者共感染在某些时间点对细胞因子反应有增强效应，但这种效应是独立于DNT存在的。
   综上所述，本研究表明在猪呼吸道感染的早期阶段，DNT并非影响B. bronchiseptica致病性及其与S. suis共感染相互作用的关键因子。促进共感染的机制可能与其他毒力因子或细菌直接与宿主细胞的相互作用有关。该研究为深入理解猪呼吸道复合感染的病理机制提供了重要依据，并凸显了ALI和PCLS模型在宿主-病原体及病原体-病原体相互作用研究中的价值。