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本文揭示了哺乳动物正呼肠孤病毒（T3DPL）作为溶瘤疗法，在治疗乳腺癌时面临的受体异质性挑战。研究以小鼠E0771乳腺癌细胞为模型，发现高亲和力受体JAM-A的缺乏是感染受限的主要原因。野生型病毒的唾液酸结合在生理温度（37°C）下不稳定，而截去σ1蛋白JAM-A结合域的工程化病毒变体，通过在唾液酸结合域引入突变（如G196R、N206H）或添加RGD基序，可在37°C下稳定结合唾液酸或整合素，从而绕过JAM-A需求高效感染。该工作为克服溶瘤病毒治疗中的受体稀缺性和热力学屏障提供了新策略，也为病毒适应受体缺乏环境的机制提供了新见解。
增强的唾液酸结合在生理温度下促进行病毒感染低受体乳腺癌细胞
引言
工程化或天然存在的溶瘤病毒（OVs）为癌症治疗提供了双重机制：选择性在转化细胞内复制并直接裂解细胞，同时触发靶向残留疾病的抗肿瘤免疫反应。了解决定溶瘤病毒成败的关键因素对于推进病毒疗法和基础癌症生物学至关重要。哺乳动物正呼肠孤病毒是一种天然存在的非致病性肠道病毒，是候选溶瘤病毒。未经修饰的血清型3 Dearing PL实验室毒株在针对包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的II/III期临床试验中表现出良好的耐受性，但其治疗效果仍然有限，反应率常不尽如人意。鉴于T3DPL在乳腺癌临床试验中持续受到关注，了解部分乳腺肿瘤抵抗呼肠孤病毒感染的机制并制定克服这些限制的策略至关重要。目前研究确定了限制T3DPL在乳腺肿瘤中活性的多种宿主和环境因素，但受体可用性是否从根本上限制T3DPL在某些乳腺癌细胞中的感染仍不清楚。
E0771细胞是溶瘤呼肠病毒感染的一个易感性差的乳腺癌靶标
为了更好理解T3DPL介导的溶瘤在乳腺癌中的局限性，需要多种同系、免疫健全的小鼠模型来捕捉T3DPL的直接肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤免疫治疗机制。免疫荧光和流式细胞术分析表明，与L929、TUBO和EMT6细胞相比，E0771细胞在暴露于相同数量的病毒颗粒时，表现出明显更低的感染率。E0771细胞的感染剂量中值（ID50）约为2.8×106颗粒/细胞，相对于L929细胞易感性降低了约10,000倍。这些数据表明E0771乳腺癌细胞对T3DPL感染易感性差，为研究限制某些乳腺癌中高效T3DPL感染的机制提供了新的模型系统。
呼肠病毒在生理温度（37°C）下对E0771细胞的附着受损
病毒感染的第一步是附着于细胞。研究发现，在生理温度（37°C）下，T3DPL能有效附着于L929细胞，但对E0771细胞的附着显著减少。在4°C时，T3DPL可以结合E0771细胞，但升温至37°C后，结合的病毒颗粒会从细胞上解离而非内化。这表明野生型病毒对E0771细胞的唾液酸相互作用是热不稳定的，在生理温度下无法稳定结合。这种温度依赖性附着以前未被描述，强调了在生理温度下研究病毒附着的重要性，以便准确预测病毒嗜性。
E0771细胞高亲和力呼肠病毒附着受体JAM-A的表达量极低
对细胞表面受体表达的分析显示，E0771细胞表面α2,6-连接唾液酸和β1整合素的丰度与L929细胞相当，但JAM-A的表达水平显著低于L929细胞。这表明E0771细胞缺乏高亲和力受体JAM-A，这很可能是导致T3DPL附着不良和感染性差的主要原因。
外源性JAM-A表达恢复了T3DPL对E0771细胞的附着，克服了高亲和力受体缺乏的限制
为了验证JAM-A缺乏是否直接导致附着缺陷，研究者在E0771细胞中外源性表达了人JAM-A（hJAM-A），产生了稳定表达hJAM-A的E0771+JAM细胞系。流式细胞术证实，与空载体对照组相比，E0771+JAM细胞表面hJAM-A表达量极高。附着实验表明，JAM-A的表达显著增强了T3DPL在37°C下对E0771细胞的附着。感染实验进一步证实，外源性表达hJAM-A足以支持原本不易感的E0771细胞发生高效的T3DPL感染。这些结果证明，低附着是高亲和力受体水平低下的主要后果，而非附着后限制。
呼肠病毒σ1截短变体可在生理温度（37°C）下有效感染JAM-A缺陷的E0771细胞
研究筛选了实验室已有的呼肠病毒突变体库，发现三种σ1截短变体能够有效感染E0771细胞：T3DPL-σ1(1-251)-G196R、T3DPL-σ1(1-251)-N206H和T3DPL-σ1(1-251)-RGD。这些变体的σ1蛋白JAM-A结合头部结构域被移除，仅保留了唾液酸结合的尾部结构域。G196R和N206H变体在截短的σ1尾部携带了点突变，而RGD变体则在截短的σ1蛋白C末端引入了RGD基序，旨在结合β1整合素。这些变体在JAM-A充足的L929细胞上表现出与野生型相当的感染性，更重要的是，它们能在缺乏JAM-A的E0771细胞上建立有效感染，而野生型病毒则不能。子代病毒滴度测定显示，在缺乏JAM-A的细胞中，G196R变体比野生型病毒能产生更多的子代病毒。
呼肠病毒σ1截短变体在生理温度（37°C）下对JAM-A缺陷E0771细胞的附着能力增强
为了直接测试JAM-A非依赖性细胞附着是否是其感染性增强的基础，研究量化了这些变体在4°C和37°C下对JAM-A缺陷细胞的结合能力。在37°C下，野生型T3DPL对JAM-A缺陷的E0771细胞几乎不结合，而三种σ1截短变体均表现出显著的附着增强。通过使用氯丙嗪（CPZ）、氯化铵（NH4Cl）或固定细胞（“幽灵”细胞）等多种方法抑制内化或解离，均证实了变体在37°C下的稳定附着。这表明σ1截短变体在生理温度下拥有更广泛、温度非依赖性的机制，绕过了对高亲和力受体的需求。
移除σ1 JAM-A附着结构域会产生选择压力，促进唾液酸结合区突变
当研究者试图通过反向遗传学获得纯野生型序列的σ1截短病毒时，发现移除σ1头部结构域施加了强大的选择压力。在连续传代后，所有拯救出的病毒都发生了补偿性突变。其中四分之三的病毒在唾液酸结合区获得了点突变（如G196R、N206K、T193M），而其余的病毒则通过突变或缺失引入了的终止密码子，恢复了全长或近全长的σ1蛋白。这表明显性、未经突变的截短σ1尾部在标准繁殖条件下可能无法存活，因为它缺乏在37°C下稳定附着所需的特性。新获得的携带点突变的截短变体在37°C下对JAM-A缺陷细胞表现出增强的附着能力，而恢复了全长σ1的变体则表现与野生型类似，无法附着。
呼肠病毒变体在生理温度下对E0771细胞的附着增强并非由病毒颗粒上σ1附着蛋白数量增加引起
通过琼脂糖凝胶电泳分析病毒颗粒上σ1三聚体的数量，发现野生型T3DPL与各种σ1截短变体（包括G196R、N206H和RGD变体）之间，平均每个病毒颗粒携带的σ1三聚体数量没有显著差异。因此，附着增强并非源于病毒颗粒表面附着蛋白密度的增加，而是由于单个σ1相互作用在37°C下的热稳定性增强。
唾液酸结合域的突变增强了生理温度（37°C）下唾液酸介导的结合
为了确定σ1截短变体是否通过唾液酸依赖机制与细胞结合，研究用神经氨酸酶处理细胞以去除唾液酸。结果显示，神经氨酸酶处理完全消除了G196R、N206H和RGD变体在4°C和37°C下对L929和E0771细胞的附着。在唾液酸生物合成缺陷的U937细胞模型中也得到了相同结论。相反，野生型T3DPL仍可结合神经氨酸酶处理的L929细胞，因为它可以通过σ1头部结构域结合JAM-A。为了验证唾液酸是否足以介导结合，研究使用了富含唾液酸但缺乏JAM-A和β1整合素的红细胞（RBCs）作为模型。在37°C下，G196R和N206H变体对红细胞的附着能力显著优于野生型病毒，而RGD变体则没有明显增强。此外，在σ1全长蛋白背景下引入G196R突变（T3DPL-σ1(G196R)）也表现出附着增强的趋势，但由于该突变导致病毒颗粒上σ1三聚体数量大幅减少，其增强效应不如在截短背景下明显。这些结果证明，G196R和N206H等突变通过赋予病毒-细胞相互作用热稳定性，直接增强了唾液酸依赖性附着。
讨论
本研究揭示了E0771乳腺癌细胞对T3DPL易感性差的直接原因是高亲和力受体缺乏，这可通过外源性表达JAM-A完全逆转。因此，E0771细胞为研究JAM-A缺陷型乳腺癌提供了一个有价值的同系模型。其次，研究发现T3DPL对JAM-A缺陷细胞和红细胞的附着具有热不稳定性，在生理温度下结合力大幅降低。这强调了在生理温度下进行研究以准确预测病毒嗜性和治疗效果的的必要性。第三，携带单个氨基酸突变（G196R、N206H/K/Y、T193M）或RGD结构域的σ1截短变体，可成功绕过对高亲和力受体的需求，在37°C下实现稳健感染。其机制在于，σ1突变直接增强了唾液酸依赖性结合的热稳定性。值得注意的是，G196R突变在截短的σ1蛋白中比在全长蛋白中益处更大，因为该突变在全长蛋白背景下会减少病毒颗粒上的σ1数量。总之，这些结果表明，通过简单的σ1基因修饰可以补偿乳腺癌中的高亲和力受体缺乏，可能拓宽呼肠病毒的治疗窗口。最后，呼肠病毒的快速适应能力凸显了唾液酸结合域的进化可塑性，并为研究病毒受体适应提供了稳健的模型。
材料与方法
研究使用了多种细胞系，包括L929、HEK 293T/17、TUBO、EMT6、E0771、U937等，均在标准条件下培养。通过位点定向突变和反向遗传学技术拯救和纯化重组病毒。病毒滴度通过噬斑测定确定。病毒颗粒通过光密度和蛋白质印迹进行标准化。通过流式细胞术量化病毒附着、细胞内病毒复制和细胞表面受体表达。蛋白质印迹用于分析病毒蛋白。通过免疫荧光显微镜观察感染。使用氯丙嗪、氯化铵或细胞固定等方法研究病毒的附着与解离。通过逆转录病毒转导构建稳定表达hJAM-A的E0771细胞系。使用人B型红细胞评估唾液酸依赖性附着。利用UCSF ChimeraX进行σ1唾液酸结合口袋的结构建模。
