《Microbiology Spectrum》：Effectiveness of two-stage inoculation of Bacillus subtilis and Bacillus megaterium on nitrogen transformation and microbial community in cow manure composting under low temperatures
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本文推荐一项针对低温环境下牛粪堆肥效率提升的创新研究。该研究探讨了在1.2°C–12.6°C低温条件下，分两阶段接种新型冷适应微生物复合菌剂（NCMCA，含枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌），可显著延长高温期、提升堆肥峰值温度，并有效促进氮素保留。研究表明，NCMCA能将累积氨（NH3）排放降低11.82%，同时使总凯氏氮（TKN）和硝酸盐氮（NO3--N）含量分别增加9.58%和42.03%。通过深入分析微生物群落演替与功能基因（如amoA, nirS, nirK, nosZ）表达，揭示了NCMCA通过调控细菌网络、增强硝化作用、抑制反硝化过程来实现高效氮素转化与保留的机制。这项工作为寒冷地区农业废弃物的可持续处理与资源化利用提供了经济高效且环境友好的微生物强化策略。
研究背景与目的
牛粪作为畜牧业主要副产品，其传统处理方式存在占地、异味、病原体传播及重金属污染等环境风险。堆肥是将其转化为有机肥料的有效方式，但在低温环境下，微生物活性受抑制，导致启动困难、效率低下且氮素损失严重。本研究旨在评估一种新型冷适应微生物复合菌剂（New-Cold adapted Microbial Consortium Agent, NCMCA，由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）以1:1比例组成）在低温（环境温度1.2°C–12.6°C）条件下，通过两阶段接种（第1天和堆肥冷却期的第28天）对牛粪堆肥过程、氮素转化及微生物群落动态的影响，以解决寒冷地区堆肥难题。
材料与方法
研究以新鲜牛粪和干小麦秸秆为原料，调节初始碳氮比（C/N）为30，水分含量（MC）为65%。设置对照组（接种等量无菌水）和NCMCA处理组（在两阶段分别接种5% vol/wt，浓度为1 × 108CFU/mL的NCMCA）。堆肥在100L好氧反应器中进行56天。定期监测温度、pH、电导率（EC）、水分含量（MC）等理化参数。采用标准五点采样法收集样品，分析总凯氏氮（TKN）、铵态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）含量，并利用气体色谱法和滴定法测定氧化亚氮（N2O）和氨（NH3）的排放。在第0、7、28、56天采集样品，通过16S rDNA高通量测序分析细菌群落结构，并使用实时荧光定量PCR（qPCR）技术定量分析硝化与反硝化功能基因（amoA, nirS, nirK, nosZ）的丰度。数据采用SPSS进行统计分析，并利用结构方程模型（SEM）探究各因素间的因果关系。
结果与讨论
1. 堆肥理化参数变化
NCMCA接种显著提升了堆肥效率。与对照组相比，NCMCA处理组的峰值温度从52.2°C提高至59.8°C，高温期（>50°C）持续时间从3天延长至6天。第二次接种（第28天）后，NCMCA处理组温度再次升高至47.4°C，而对照组无显著变化，证实了NCMCA的升温效应。整个过程中，两组的pH值变化趋势一致，初期升高后下降，最终趋于稳定。NCMCA处理组的电导率（EC）始终高于对照组，表明其促进了有机物分解产生更多可溶性盐，但最终值仍在安全范围内（<4.0 mS/cm）。在水分含量方面，NCMCA处理组的降幅更大，尤其在第二次接种后的一周内，水分含量降低了6.34%，而对照组仅降低0.71%，显示了NCMCA加速代谢和水分蒸发的效果。
2. 氮素动态变化
NCMCA处理在氮素保留方面表现优异。累积NH3排放量为7.30 g，较对照组（8.28 g）显著降低11.82%。堆肥结束时，NCMCA处理组的总凯氏氮（TKN）和硝态氮（NO3--N）含量分别为27.12 g/kg和484.5 mg/kg，较对照组（24.64 g/kg和341.3 mg/kg）分别增加了9.58%和42.03%。氧化亚氮（N2O）的累积排放量在两组间无显著差异。氮素平衡计算显示，NCMCA处理组的氮回收效率高达91.23%，远高于对照组的73.85%，证实了其卓越的氮素保存能力。
3. 细菌群落的丰度与多样性
Alpha多样性分析显示，堆肥时间和NCMCA处理单独或交互作用均显著影响微生物群落多样性。在堆肥后期（第56天），NCMCA处理组的物种观察数（Observed OTUs）和Chao1指数均显著高于对照组，表明NCMCA处理丰富了堆肥后期的细菌群落。Beta多样性分析（PCoA）表明，在堆肥结束时，NCMCA处理组与对照组的细菌群落结构存在显著差异，证实了NCMCA对群落结构的重塑作用。
4. 堆肥过程中微生物群落的动态变化
在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）是优势菌门。与对照组相比，NCMCA处理降低了变形菌门的相对丰度，但增加了绿弯菌门、放线菌门和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）的丰度。在属水平上，NCMCA接种增加了Candidatus_Chloroploca和Ruminofilibacter的相对丰度，降低了Devosia、Pusillimonas和Hydrogenophaga的相对丰度。功能预测（PICRUSt2）分析显示，NCMCA处理组在碳水化合物消化吸收和甘露糖型O-聚糖生物合成等相关代谢通路的活性显著高于对照组。
5. 氮转化功能基因分析
qPCR结果显示，在堆肥冷却期和成熟期，NCMCA处理组的氨氧化细菌功能基因（amoA）丰度显著高于对照组，表明其硝化作用增强。同时，NCMCA处理在冷却期显著降低了nirK型反硝化细菌的基因丰度，并在整个过程中改变了nirS基因的表达模式。此外，在冷却期，将N2O还原为N2的关键基因nosZ的表达也显著上调。这些基因层面的变化共同揭示了NCMCA通过促进硝化、抑制反硝化来保留氮素的分子机制。
6. 微生物群落相关性、网络及环境因子分析
共生网络分析揭示了堆肥微生物间复杂的相互作用。例如，Luteimonas与Candidatus_Chloroploca、Thermopolyspora等属呈负相关。冗余分析（RDA）表明，细菌群落结构与温度、TKN、NH3和NO3--N等环境因子密切相关。皮尔逊相关分析发现，Pusillimonas、Ruminofilibacter等属与温度正相关，但与NO3--N和NH3累积排放负相关，有利于氮素保存；而Devosia则呈现相反的相关性。结构方程模型（SEM）进一步阐明，NCMCA的接种增强了TKN与NO3--N之间的正相关路径，同时减弱了TKN与NH3排放之间的关联，从统计学上证实了NCMCA通过促进硝化、减少氨挥发来实现氮素保留的作用通路。
结论与展望
本研究证实，在1.2°C–12.6°C的低温条件下，对牛粪堆肥进行两阶段NCMCA接种，是一种高效可靠的策略。它能快速启动并提升堆肥温度，延长高温期，优化微生物群落结构，通过刺激氨氧化细菌（amoA）、抑制nirS/nirK型反硝化细菌，从而增强硝化、抑制反硝化，最终实现减少11.82%的NH3排放，并显著提高堆肥产品中总氮和硝态氮含量的目标。该策略为寒冷地区（如中国新疆、宁夏、内蒙古等地）的农业废弃物处理提供了可持续且经济高效的解决方案。未来研究可进一步探索NCMCA在零下温度环境下的有效性，以及不同接种浓度梯度（如1%、10%）的优化应用，以拓宽其实际应用范围。
