《Microbiology Spectrum》：Neutrophil-specific transcriptomic profiling reveals a novel signature for active tuberculosis diagnosis
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本文介绍了一项开创性研究，该研究通过聚焦中性粒细胞（CD64+和CD15+亚群）的特异性转录组分析，成功筛选并验证了一个由MYL12A、EIF1、GBP5和SRSF5四个基因组成的诊断标志物（neu-TB）。该标志物在区分活动性肺结核（ATB）与潜伏感染（LTBI）、健康对照（HC）及其他肺部疾病方面表现出优异的诊断性能（AUC>0.95），为解决现有痰基诊断方法覆盖率不足的临床难题提供了高精度、非痰基的宿主反应生物标志物新策略。
引言：结核病诊断的挑战与新策略
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的重要传染病，是全球单一感染源导致死亡的主要原因。根据世界卫生组织（WHO）2025年报告，全球结核病发病率高达1070万例。活动性肺结核（ATB）是社区传播的主要来源，因此其快速准确诊断对于疾病防控至关重要。然而，当前基于痰液的检测方法对ATB的诊断覆盖率有限，导致病例漏诊和治疗延迟。尽管干扰素-γ释放试验（IGRA）能有效识别结核分枝杆菌感染，但区分潜伏性结核感染（LTBI）与ATB的能力有限。近年来，转录组学分析，尤其是RNA测序（RNA-seq），通过系统描绘宿主-病原体相互作用的分子机制，彻底改变了对结核病发病机制的理解。然而，目前基于全血或外周血单个核细胞（PBMC）的转录组研究受到细胞背景异质性的干扰，限制了其转化应用。为了最小化背景干扰，本研究将目光投向了中性粒细胞——它是结核病血液特征中最丰富的免疫细胞，也是宿主-病原体相互作用的关键介质。
研究设计与方法概览
本研究共分析了来自646名参与者的临床样本，包括271例ATB、150例LTBI、33例非结核分枝杆菌感染（NTB）和192例健康对照（HC）。研究设计包含两个发现队列、一个验证队列和两个独立评估队列。
在发现阶段，研究者对两种中性粒细胞亚群进行了转录组分析：一是从114名参与者（发现队列D1）中分离出等数量的CD64+细胞进行RNA-seq；二是利用已发表的CD15+亚群数据（发现队列D2）。差异表达基因（DEG）分析采用标准流程，并通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）在验证队列中对候选基因进行验证。通过LASSO回归模型和随机森林算法进行特征选择，最终筛选出最优的基因组合。
中性粒细胞差异表达基因的特征
对CD64+中性粒细胞的RNA-seq分析共检测到3485个信使RNA（mRNA）。与健康对照（HC）相比，ATB患者中发现了423个差异表达基因（DEG），其中223个上调，200个下调。与LTBI相比，ATB患者中发现了245个DEG（142个上调，103个下调）。热图分析清楚地显示，ATB组的基因表达谱与LTBI和HC组存在明显差异。
研究者进一步分析了CD64+和CD15+两个亚群共有的1255个表达基因（共表达基因）。功能富集分析显示，两个亚群的DEG所涉及的生物过程存在大量重叠，主要与先天免疫机制相关，包括免疫调节、信号转导激活、细胞因子生物合成和细胞表面受体信号通路。
候选基因验证与转录组标志物筛选
在验证队列中，通过qPCR检测了20个候选基因在ATB、LTBI和HC三组中的表达。结果显示，有16个基因在ATB病例与HC和LTBI组比较时表现出统计学显著差异，且所有这些DEG在ATB样本中均呈上调表达模式。随后的随机森林模型评估了这20个基因在模拟分类任务中的特征重要性，排名前五的预测特征是GBP5、MYL12A、STAT1、EIF1和SRSF5。LASSO回归分析进一步从中优选出了MYL12A、EIF1、GBP5和SRSF5这4个基因的组合。
这4个基因单独使用时，其受试者工作特征曲线下面积（AUC）在0.77至0.96之间。而当组合这四个基因的表达时，获得了最高的诊断性能，AUC达到0.984，显著优于单个基因。
4基因neu-TB标志物的诊断性能评估
研究通过接受者操作特征曲线（ROC）分析，在一个验证队列（V）和两个独立评估队列（E1和E2）中评估了4基因neu-TB标志物的区分性能。
该标志物在区分ATB与HC时表现卓越，在三个队列中的AUC值分别高达0.995、0.986和0.978，灵敏度在90.8%至96.8%之间，特异度在96.5%至100%之间。在区分ATB与LTBI时，诊断性能依然强劲，AUC值在0.958至0.975之间，灵敏度在88.5%至96.8%之间，特异度均超过92.5%。在区分ATB与HC和LTBI的合并组时，AUC值在0.973至0.984之间。尤为重要的是，该标志物还能有效区分ATB与其他肺部疾病（NTB，包括细菌性肺炎和肺癌），AUC值为0.967，灵敏度为93.0%，特异度为87.9%。
在痰涂片阳性的结核样本中，该标志物的阳性预测率在队列V和E2中达到了100%。相比之下，HC组和LTBI组的阳性率保持在10%以下，其中LTBI组的阳性率约为HC组的两倍。
讨论：创新、意义与展望
本研究采用了一种新策略来最小化背景因素的干扰，即聚焦中性粒细胞的转录组谱，从中鉴定出结核病特异性标志物。中性粒细胞在结核病的免疫病理学中扮演着关键角色。CD15+和CD64+这两个中性粒细胞亚群在多项结核病诊断研究中被频繁报道。本研究的转录组结核标志物正是通过利用这两个亚群的RNA-seq数据筛选出来的。
这4基因neu-TB标志物涉及关键的生理过程，包括先天免疫调节、炎症反应和蛋白质翻译起始。MYL12A编码肌球蛋白轻链12A；GBP5是一种鸟苷酸结合蛋白，可激活NLRP3炎症小体组装；EIF1编码真核翻译起始因子1；SRSF5是一种丝氨酸/精氨酸富集剪接因子。这四基因组合在区分ATB与其他组别时展现出卓越的准确性。
与基于全血或PBMC的研究相比，专注于关键免疫细胞（中性粒细胞）可以减少背景噪音，检测到更多功能相关的基因。本研究结果显示，中性粒细胞中的大多数DEG与免疫反应通路相关，并且鉴定出75个与干扰素-α/β通路相关的DEG，这个数量超过了以往全血和PBMC样本研究中的报道。
值得注意的是，当使用全血RNA进行qPCR时，与纯化的中性粒细胞相比，差异基因表达的幅度减弱。对于四基因中性粒细胞-TB标志物，只有GBP5在ATB与LTBI和HC组之间仍保持显著差异，而其他三个基因则失去了显著性。这进一步印证了细胞类型特异性分析的优势。
因此，neu-TB标志物反映了宿主对ATB更敏感的响应，具有广泛的诊断应用前景。鉴于磁激活细胞分选（MACS）是一项成熟技术，且qPCR在各级医院常规可用，该标志物易于适应自动化平台，具有直接的转化潜力。本研究的局限性在于，该标志物区分ATB与其他疾病的能力仍有待在大型、多队列人群中进行验证。此外，非结核分枝杆菌（NTM）感染可能提高对照组的假阳性率，而本研究队列中未包含此类样本。未来工作的主要目标是在多个独立队列中系统验证这些混杂因素。
