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本研究分离鉴定了牛蛙 ranavirus（RCRV），通过人工感染实验发现温度升高（15℃、20℃、25℃）显著增强其致病性，导致病毒复制量增加及靶器官转移（肺→肝、肾、脾），免疫应答加剧并伴随严重炎症浸润和病理损伤，为温度关联性致病机制提供了新证据。
马彦平|郝乐|梁曦|王刚|刘振星
广东省农业科学院动物健康研究所，广州510640，中国
摘要
牛蛙（Aquarana catesbeiana）是中国重要的养殖物种，目前正面临ranavirus疾病的爆发。温度在ranavirus感染过程中对两栖动物起着关键作用。然而，温度对ranavirus对牛蛙致病性的影响仍不清楚。在这项研究中，我们从患病的成年牛蛙中分离出一种ranavirus菌株，并将其命名为Aquatara catesbeiana ranavirus（RCRV）。然后，我们在15°C、20°C和25°C下设计了人工感染实验，以探究RCRV对牛蛙的致病性。死亡率分析、临床观察和组织学检查表明，RCRV的致病性随温度升高而增强。通过qPCR和免疫荧光检测发现，温度升高不仅促进了病毒复制，还改变了病毒的趋向性，主要靶器官从肺部转移到了肝脏、肾脏和脾脏。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）对差异表达基因（DEGs）进行通路分析，以及苏木精-伊红（HE）染色结果证实，温度升高激活了更强烈的免疫反应，伴随严重的炎症浸润和组织损伤。这些发现有助于更好地理解RCRV的温相关性毒力和致病机制。
引言
虹彩病毒属于Iridoviridae科，是一类大型胞质DNA病毒，包含七个属：Ranavirus、Lymphocystivirus、Megalocytivirus、Iridovirus、Chloriridovirus、Daphniairidovirus和Decapodiridovirus。其中，ranavirus是一类新兴的病原体，导致全球范围内圈养和野生两栖动物、鱼类和爬行动物的大规模死亡，使其成为水产养殖中最严重的传染性病原体之一（Wirth等，2018；Campbell等，2020；Zhao等，2023；Apakupakul等，2024；Marschang等，2024）。自1996年以来，ranavirus在中国造成了严重的养殖两栖动物产业损失，并破坏了两栖动物种群的生物多样性，尤其是青蛙的死亡率超过了80%（Zhang等，1996；Mu等，2018；Zheng等，2025）。
牛蛙Aquarana catesbeiana是一种大型可食用青蛙，是一种有前景的养殖物种，但目前受到ranavirus的威胁（Brunner等，2019；Ash等，2024）。在我们对影响牛蛙的病毒性疾病进行的流行病学调查中，检测到了ranavirus，并将其命名为Aquatara catesbeiana ranavirus（RCRV），其感染性受温度变化的影响。越来越多的证据表明，温度与ranavirus的复制和致病性有关（La Fauce等，2012；Rayl和Allender，2020；Wirth和Ariel，2020），相应地，感染ranavirus的两栖动物、鱼类和爬行动物表现出温度依赖性的疾病（Brunner等，2015；Allender等，2018；Wirth和Ariel，2020；Zhao等，2023）。在22°C时，龟体内的病毒载量比28°C时更高（Allender等，2013）。Ranavirus的典型物种Frog virus 3（FV3）在体外温度升高至32°C时复制迅速（Gravell和Granoff，1970；Ariel等，2009）。在25°C时，木蛙幼体、Cope’s灰树蛙幼体和绿蛙幼体内的FV3拷贝数和死亡率均高于10°C时（Brand等，2016）。此外，还发现FV3感染在秋季和冬季比夏季更为普遍（Gray等，2007；Brunner等，2015）。尽管牛蛙幼体对ranavirus的敏感性更高，但成年牛蛙也仍然面临风险。然而，很少有研究比较成年牛蛙对不同温度的敏感性（Gray等，2007；Brunner等，2015；Brand等，2016）。
成年牛蛙对ranavirus的敏感性、趋向性和致病机制，尤其是受温度影响的机制，尚未得到充分认识。此外，许多研究表明，ranavirus感染引起的两栖动物免疫反应在不同生命阶段存在显著差异（De Jesus Andino等，2012；Dallas和Warne，2023），并且两栖动物的免疫系统活性也依赖于温度（Rollins-Smith，2017；Assis等，2023；Corrie等，2024）。环境温度升高可能引发行为性发热，激活免疫反应以减少病毒复制和宿主死亡率（Sauer等，2019；Wirth和Ariel，2020）。阐明免疫反应、温度和ranavirus感染之间的相互作用将有助于我们更好地理解成年牛蛙中ranavirus的致病机制，并提供缓解ranavirus感染相关死亡率的策略。
在本研究中，我们旨在确定温度对成年牛蛙中RCRV复制和分布的影响，以及免疫反应与RCRV感染之间的关系。为此，我们进行了一系列实验，包括挑战试验、qPCR、苏木精-伊红（HE）染色、免疫荧光和转录组测序。这项工作将有助于揭示温度变化对RCRV致病性的影响。
实验动物
成年牛蛙（100克±20克）来自中国广东省江门的当地牛蛙孵化场。这些成年牛蛙没有疾病症状和死亡现象。在送往实验室之前，通过qPCR确认了10只牛蛙未感染ranavirus。研究开始前，将牛蛙随机分为3组（每组40只），并在15°C、20°C和25°C的恒定温度控制设施中饲养
病毒分离与鉴定
用患病成年牛蛙的病毒匀浆液感染的EPC细胞在感染后72小时表现出典型的细胞病变效应，包括细胞收缩、变圆、伸长和从细胞层脱落（图1b）。从感染EPC细胞悬浮液中提取的DNA进行Taqman qPCR分析，结果显示为ranavirus阳性。随后，将感染细胞制备成超薄切片，通过透射电子显微镜观察，发现病毒具有虹彩病毒的特征
讨论
温度在ranavirus感染导致的鱼类、两栖动物和爬行动物的存活和疾病进展中起着关键作用（Rojas等，2005；Allender等，2013；Rayl和Allender，2020）。先前的研究表明，较高的水温为FV3感染创造了有利条件，发现在25°C时，木蛙、斑点蝾螈、Cope’s灰树蛙和绿蛙幼体的死亡率高于10°C时的死亡率（Brand等，2016）。
作者贡献声明
马彦平：撰写初稿、软件使用、方法学设计、数据分析、概念构建。郝乐：监督工作、资源提供、方法学指导。梁曦：资源提供、方法学指导。王刚：撰写与编辑、监督工作、概念构建。刘振星：撰写与编辑、资金争取、概念构建。
利益冲突声明
所有作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
本研究部分得到了汕尾市科技规划项目（2024D029）、广东省动物疾病预防重点实验室（2023B1212060040）和汕尾市科技创新项目（2024E003）的支持。
