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αB-晶体蛋白经甲基甘油醛（MGO）修饰后呈现双重功能效应：MGO通过形成甲基甘高质量发展的交联结构修饰8个赖氨酸残基，削弱其抑制猫眼酶热聚集和促进果糖-1,6-二磷酸脱氢酶折叠能力，但增强对帕金森相关突变体αSynA53T纤维化的抑制作用，形成非纤维性无序聚集体。
K.V. 巴里诺娃 | M.V. 梅德韦杰娃 | M.V. 塞列布里亚科娃 | L.P. 库罗奇金娜 | V.I. 穆罗涅茨 | E.V. 施马尔豪森
俄罗斯莫斯科国立罗蒙诺索夫大学别洛泽尔斯克物理化学生物学研究所，莫斯科 119991
摘要
αB-结晶蛋白是一种小热休克蛋白，存在于眼睛晶状体、视网膜、心脏、大脑、皮肤和骨骼肌中。αB-结晶蛋白的突变会导致白内障以及人类肌肉和心脏疾病。非酶促糖基化在αB-结晶蛋白病理过程中的作用尚未得到充分研究。本研究的目的是评估甲基乙二醛（MGO）水平升高对αB-结晶蛋白功能的影响。我们通过MGO修饰了重组αB-结晶蛋白（aB-Cr），并研究了这种修饰对其多种功能的影响：抑制蛋白质热聚集的能力、促进蛋白质重折叠的能力，以及抑制α-突触核蛋白A53T（αSynA53T，与早发性帕金森病相关的突变）的淀粉样聚集能力。实验表明，MGO会修饰每个αB-Cr亚基中的8个精氨酸残基，生成甲基乙二醛衍生的氢咪唑酮（MG-H），并导致蛋白质亚基之间的交联。这种修饰降低了αB-Cr抑制过氧化氢酶热聚集的能力以及促进甘油醛-3-磷酸脱氢酶重折叠的能力。同时，MGO修饰增强了αB-Cr抑制αSynA53T纤维化的能力：添加天然αB-Cr会产生较短的纤维，而MGO修饰后的αB-Cr则完全阻止了αSynA53T的纤维化，形成的无定形聚集体对细胞的毒性低于αSynA53T纤维。因此，MGO对αB-结晶蛋白不同功能的影响可能有所不同，从而导致其活性的增加或减少。
章节摘录
引言
α-结晶蛋白是脊椎动物眼睛晶状体的主要成分，由αA和αB结晶蛋白单体组成的多聚复合物，属于小热休克蛋白家族。αA与αB的摩尔比为3:1 [1]。
αB-结晶蛋白会组装成475 kDa的寡聚体，每个寡聚体由24个20 kDa的亚基构成。利用电子显微镜对αB-结晶蛋白进行三维（3D）重建显示其具有球形结构，并且内部有一个空腔。
化学试剂
在本研究中，我们使用了以下化学试剂：硫酸铵（Merck KGaA）；二硫苏糖醇（DTT）（Amresco）；乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）、甘氨酸（MP Biomedicals）；甘油醛-3-磷酸二乙酰钡盐、甲基乙二醛、NAD+（Sigma-Aldrich）。
从生产细胞中分离重组人αB-结晶蛋白
为了生产αB-结晶蛋白（αB-Cr），我们使用了携带野生型αB-结晶蛋白编码序列的pET23b+质粒转化的大肠杆菌 BL21(DE3)菌株（该质粒由他人提供）。
甲基乙二醛对αB-结晶蛋白的修饰导致亚基间交联
为了检测αB-结晶蛋白在甲基乙二醛（MGO）作用下的变化，我们将重组αB-结晶蛋白（αB-Cr）溶液与不同浓度的MGO在37°C下孵育24小时后，通过SDS电泳进行分析（图1）。
如图1所示，αB-Cr与1 mM MGO孵育24小时后出现40 kDa的条带，表明αB-Cr亚基之间形成了交联（见第3条泳道）。
讨论
本研究表明，在生理pH值下，MGO对αB-Cr的修饰会导致亚基间形成交联。这些交联不是二硫键，因为首先αB-Cr不含半胱氨酸，其次SDS-PAGE是在还原条件下进行的。据文献报道，MGO可以使蛋白质中的赖氨酸残基交联形成甲基乙二醛-赖氨酸二聚体[30]，或者使赖氨酸和精氨酸残基交联形成其他结构。
结论
在生理pH值下，MGO对αB-Cr的修饰会导致每个αB-Cr亚基中的8个精氨酸残基生成甲基乙二醛衍生的氢咪唑酮（MG-H）。已鉴定出四个被修饰的精氨酸残基：R74、R116、R157和R163。此外，还有四个MG-H衍生物：一个位于肽段1-25中，一个位于肽段35-67中，两个位于肽段118-156中。
αB-Cr中精氨酸残基的修饰降低了该蛋白某个结构域的热稳定性。
作者贡献声明
K.V. 巴里诺娃：数据可视化、实验研究。
M.V. 塞列布里亚科娃：数据可视化、实验研究。
M.V. 梅德韦杰娃：数据可视化、实验研究。
V.I. 穆罗涅茨：撰写、审稿与编辑、资金申请。
L.P. 库罗奇金娜：数据可视化、实验研究。
埃莱娜·施马尔豪森：初稿撰写、概念构思。
资助
本研究得到了俄罗斯科学基金会（项目编号：24-44-20003，网址：https://rscf.ru/project/24-44-20003）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
MALDI-TOF质谱仪是在莫斯科国立大学PNG 5.13发展计划的支持下获得的。
