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本论文开发并验证了一种基于慢病毒假病毒的多重细胞中和试验。该体系能够同时评估人血清对三种SARS-CoV-2变异株（Wuhan-Hu-1、BA.1和XBB.1.5）的中和抗体（nAb）滴度，为高效监测人群体液免疫水平、追踪病毒演化及其免疫逃逸提供了有力的工具。研究者构建了携带不同刺突蛋白（S-protein）并表达特异荧光蛋白的假病毒，利用流式细胞术量化感染效率，并证实了其可靠性。该方法应用于俄罗斯2021-2025年人血清样本分析，揭示了中和抗体谱的演变。本工作为后疫情时代的人群免疫监测提供了高效、高通量的解决方案。
在疫情进入常态化管理阶段，持续监测人群对不断出现的SARS-CoV-2变异株的适应性免疫力，仍然是公共卫生领域的重要任务。为了满足这一需求，研究者开发了一种能够在单次试验中，同时评估血清样本对三种SARS-CoV-2变异株（包括原始毒株Wuhan-Hu-1、Omicron BA.1和XBB.1.5）中和能力的新型检测方法。
这项研究的核心是构建了一套携带不同刺突蛋白（S-protein）的慢病毒假病毒（Pseudoviral particles, PVPs）体系。具体而言，研究者分别将Wuhan-Hu-1、BA.1和XBB.1.5的S蛋白包装到复制缺陷的慢病毒颗粒表面，并在每个颗粒内部编码了独特的荧光报告蛋白（Clover、mRhubarb713或mRuby3），从而实现对不同假病毒的特异性标记和追踪。这些假病毒用于感染过表达人ACE2（hACE2）的HEK293T靶细胞，随后通过流式细胞术定量每种变异株感染的目标细胞百分比。结果显示，与单一感染对照相比，三种假病毒共同感染仅导致感染细胞百分比轻微下降，证实了该多重检测体系的稳健性。
研究人员将这一创新性工具应用于实际样本分析。他们收集了2021年至2025年间，来自俄罗斯联邦Sirius联邦管区的五位捐赠者的血清样本。通过该多重中和试验分析，得出了两个关键发现：首先，在2021年（即Omicron出现前）收集的血清能够有效中和Wuhan-Hu-1毒株，并对BA.1表现出交叉中和活性，但对XBB.1.5则不具备中和能力。其次，在Omicron出现后收集的血清样本，能够中和Wuhan-Hu-1和BA.1，并对XBB.1.5表现出较弱的中和能力。这些结果直观地展示了人群中和抗体谱如何随着时间推移和病毒变异而动态演变。
在方法学上，该研究详细描述了假病毒的生产、定量和中和试验流程。通过聚乙烯亚胺（PEI）介导的转染，在HEK293T细胞中产生假病毒颗粒，并进行纯化浓缩。中和试验时，将系列稀释的人血清样本与最佳浓度的假病毒混合孵育，之后加入靶细胞。感染48小时后，通过流式细胞术检测荧光阳性细胞比例，并利用公式Neutralization (%) = (1 - %serum/ %no serum) × 100%计算中和百分比。其中，%serum代表加入血清样本后的荧光细胞百分比，%no serum代表未加血清对照的荧光细胞百分比。50%中和滴度（NT50）则通过GraphPad Prism软件进行非线性回归分析获得。
该研究开发的这种基于荧光报告基因的多重假病毒中和试验，相较于传统的单一检测方法，显著提升了检测效率和通量。它不仅能够在一个反应孔内同时评估对多种变异株的免疫力，节省了珍贵的临床样本和试剂，其基于流式细胞术的检测方式也提供了高灵敏度和定量能力。在Omicron及其亚型持续变异、多种毒株共循环的背景下，这种高效的多重检测工具对于快速评估现有疫苗和既往感染诱导的交叉保护免疫、追踪病毒免疫逃逸趋势、以及指导公共卫生决策具有重要的应用价值。它为在生物安全二级（BSL-2）实验室环境下，系统性地描绘人群的体液免疫图谱和监控其动态变化提供了一个宝贵的平台。
