《mSystems》：S'Wipe: user-friendly stool collection for high-throughput gut metabolomics and multi-omics
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本文综述了粪便采样在代谢组学应用中的技术瓶颈，并介绍了S'Wipe这一革命性的解决方案。该方法利用无尘纸巾作为采样载体，配合乙醇保存液，实现了无需冷藏、可常温邮寄的粪便样本采集。验证研究表明，S'Wipe能稳定捕获包括短链脂肪酸（SCFAs）在内的多种挥发性与非挥发性代谢物，其性能与传统直接取样法相当，且样本兼容气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析。该方法成本低廉、操作简便，有望突破大规模人群研究、纵向追踪和个性化医疗应用中的采样壁垒。
摘要
肠道微生物组通过产生包括短链脂肪酸（SCFAs）在内的多种代谢物，在人体健康中扮演着核心角色。这些分子是反映微生物组和/或饮食变化的重要生物标志物，其改变与从癌症到结肠炎等多种胃肠道疾病相关。尽管潜力巨大，但粪便采集的技术挑战限制了其临床转化。本文介绍了一种超低成本的粪便采集新方法——粪便擦拭法（S‘Wipe）。该方法使用质谱（MS）兼容的无尘纤维素擦拭纸作为厕纸，样本在乙醇中保存且无需冷藏，可通过普通邮件寄送。质谱分析表明，S‘Wipe能够以良好的重复性和稳定性捕获挥发性和非挥发性代谢物。研究显示，S‘Wipe的表现与直接粪便采集法相当，使得两者可互换使用并与现有研究进行比较。该方法非常适合大规模人群研究、纵向追踪和个性化医疗应用。
引言
肠道微生物组通过营养代谢、免疫调节和包括生物活性代谢物生产在内的代谢调节，以深刻而广泛的方式影响人类健康。其中，短链脂肪酸（SCFAs）已成为肠道健康特别重要的生物标志物。这些细菌代谢物已被广泛验证为关键的肠道健康指标，研究表明它们对消化、代谢、免疫甚至心理健康等过程均有影响。SCFAs主要由膳食纤维发酵产生，随后遍布全身，影响多种组织和生理过程。这些微生物代谢物作为可测量生物标志物的临床潜力不断在各类研究中被揭示——从炎症性肠病（IBD），到与肥胖和心血管疾病等当代流行病相关的炎症级联反应和代谢综合征。SCFAs的缺乏或失衡与低纤维摄入饮食、肠道通透性改变和炎症有关，从而促进胰岛素抵抗，升高风险因素，增加心血管事件概率。SCFAs的定量和分析为非侵入性监测提供了临床机遇，不仅用于疾病诊断，还可用于早期风险评估、暴露-反应监测，以及指导营养或治疗性肠道微生物组调节。
然而，与肠道微生物组相关的分子虽然与多种健康状况存在明确关联，但由于高度的生物学和技术变异性，将这些发现转化为临床生物标志物仍然充满挑战。当前的采样方法在数据收集中存在重大实际障碍。粪便样本在环境条件下会因化学降解和微生物生长而迅速变质。此外，对专业采集和处理基础设施的依赖，加上采集方案的成本和复杂性，带来了巨大的物流挑战。不同研究间非标准化的采样协议进一步加剧了这些困难。因此，目前尚无广泛可及、可靠的肠道分子生物标志物个性化监测方法。最后，或许也是最重要的一点，粪便采集令许多人感到不适，从而阻碍了个人参与需要粪便检测的研究，尤其是在需要频繁纵向采样时。
目前的粪便采样方法，主要用于微生物组和代谢组学分析，在临床实践中主要是传统的粪便采集试剂盒，包括便盆、拭子或小容器。通常，粪便需要在屏幕上收集，然后手动转移到存储容器中。对于某些方法，样本必须立即冷冻，然后冷冻运输到实验室以保持其完整性。由于存储和运输温度、运输时间以及患者间确切采集方法的差异，这可能导致高度的变异性。一个当前使用方法的例子是粪便隐血试验（FOBT）卡片。在FOBT采样中，粪便涂片在家中被收集在专门设计的、用于检测血液的样本卡片上。这些卡片有助于在室温（RT）下运输时稳定一些分子。然而，干燥会改变分子组成。此外，样本量小以及卡片使用和处理的困难限制了更广泛的分析。专门的解决方案如Cologuard可用于非侵入性测试，分析患者在含有保存液的商业试剂盒上收集的粪便样本。该测试使用基因测序检测结直肠癌前病变，但未针对代谢组学进行优化。对于大多数基于粪便的测试，粪便是在研究实验室或医院收集的，临床医生可能直接采集粪便样本，或在灌洗或内窥镜活检等手术过程中采集。显然，此类侵入性技术限制了实际的可扩展性。
总体而言，可扩展、对患者和消费者友好、且在非冷藏运输过程中保持完整性的采样方法，仍然是一个未满足的需求。依赖立即冷冻的传统采集方案是目前最先进的技术，但对于人群水平的研究来说，在物流上不切实际。为了弥合这一差距，我们开发了粪便擦拭法（S’Wipe），一种用户友好、超低成本的粪便采集方法。
结果
可行性试点研究
为确立S‘Wipe用于代谢组学分析的可行性，我们首先优化了提取方案，并确认了目标代谢物的捕获。由于S‘Wipe允许测量粪便重量，因此可以对代谢物丰度进行标准化。此外，通过使用外部校准，可以计算各种分子的绝对数量，并将其用作生物标志物以获取生活方式或其他信息。代谢物的比率不依赖于绝对定量，也可以与特定状况相关联。
我们主要关注三种具有既定诊断重要性的SCFAs——乙酸、丙酸和丁酸，以及其他SCFAs和对甲酚。比较显示，S‘Wipe捕获这些代谢物的样本间一致性与传统方法相当或更好。统计分析显示，所有时间点的平均相对标准偏差为23.48%。虽然测量的浓度在三种采集方法中吻合良好，但S‘Wipe在重复测量中表现出较低的变异性。一个显著的例外是乙酸，由于挥发性高，在所有方法中都表现出高变异性。
稳定性研究：室温存储验证
为了评估样本在非冷藏储存和运输过程中是否保持稳定，我们评估了SCFAs在室温下多天的稳定性。GC-MS分析显示，所有九种SCFAs在研究期间都表现出显著的稳定性——在室温储存期间未观察到明显的降解。GC-MS分析表明变化可忽略不计，在环境温度下多天的时间间隔内没有统计学上显著的降解趋势。SCFAs在室温下7天的稳定性与Giampietro等人的研究结果一致，他们使用Matrix Method工作流程验证了95%乙醇可用于1周的室温保存。短链脂肪酸检测的定量线性跨越生理浓度范围。绝对浓度与传统方法收集样本报告的值一致，证实了组成的完整性。
不同样本处理条件下各种SCFAs的标准偏差显示小于20%。运输条件反映了环境条件波动的代表性总和，特别是暴露于高温和湿度的情况。SCFAs的测量丰度在所有三种样本处理场景中都是一致的，表明其降解不明显。所有代谢物的变异系数在所有样本中小于或等于20%，这表明在处理策略下，SCFAs的丰度相似。
基准研究：与传统方法比较
为了全面评估潜在的方法特异性偏倚，我们比较了S‘Wipe捕获的更广泛的代谢组与通过传统粪便采集获得的代谢组，分别使用GC-MS和LC-MS检查了挥发性和非挥发性分子。主坐标分析（PCoA）显示，直接采集和S’Wipe具有相似性，而OMNIgene Gut则显著不同。然后，我们采用分子网络分析来可视化和比较方法间捕获的分子家族。各种SCFAs的丰度在S‘Wipe和传统收集中总体上具有可比性和一致性。LC-MS分析表明，非挥发性生物源分子，包括氨基酸、胆汁酸、维生素和各种微生物代谢物，也被两种方法类似地捕获。S’Wipe和直接采集之间的一个显著差异是背景分子，主要是由采集基质贡献的聚乙二醇
