内生真菌Clonostachys rosea的脂肪酶催化的酯交换反应和酰胺转移反应：支链共轭脂肪酸及其衍生物的细胞毒性作用

Clonostachys rosea SBP-A分离自白蜡树根，鉴定出新型脂肪酸4-Me-6E,8E-hexadecadienoic acid（1）及其酯和酰胺衍生物。通过溶剂提取和酶学实验证实，真菌脂酶催化MeOH与1发生酯交换，但对常见脂肪酸无特异性，转酰胺反应则选择性作用于硬脂酸。1及其衍生物显示中等抗NCI-H460肺癌细胞活性，但1对正常MRC-5肺成纤维细胞具有显著毒性（IC50=20.68 μM），暗示其在真菌生物控制机制中的作用。

　　

杨丹丹|Padchanee Sangthong|Atchara Janthong|Kraikrit Utama|Sanya Sureram|Tawatchai Thongkongkaew|雷晓光|Anongnuch Sasnarukkit|Chulabhorn Mahidol|Somsak Ruchirawat|Prasat Kittakoop

泰国曼谷Laksi的Chulabhorn研究生院化学科学系，邮编10210

摘要

真菌Clonostachys rosea在生物防治方面具有潜在应用价值，其商业化的生物防治产品已在全球范围内使用。在本研究中，从Morus alba的根部分离出了内生真菌C. rosea SBP-A，并从真菌提取物中分离出一种特殊的脂肪酸——4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1）。研究发现，这种特殊的脂肪酸1是C. rosea脂质中的甘油三酯成分之一。我们发现，通过甲醇（MeOH）提取获得的该脂肪酸的甲酯2是由C. rosea细胞中的脂肪酶催化的酯交换反应生成的。本研究还证实了脂肪酶在C. rosea细胞中的酯交换和转酰胺化反应。值得注意的是，脂肪酶催化的酯交换反应仅针对特殊的脂肪酸1，生成酯2-6；而转酰胺化反应则选择性地作用于常见的脂肪酸硬脂酸，生成酰胺7-9。由于脂肪酶具有耐热性和广泛的酶活性，这意味着如果使用甲醇或乙醇作为提取溶剂，可能会得到天然产物的甲酯或乙酯衍生物。酯和酰胺衍生物2-9未表现出细胞毒性，而特殊的脂肪酸1对NCI-H460肺癌细胞表现出中等程度的细胞毒性。流式细胞术分析显示，脂肪酸1能够阻断细胞周期的G1阶段。

引言

内生真菌被认为是结构多样的生物活性化合物的丰富来源，这些化合物具有多种生物活性（El-hawary等，2020；Zhang等，2006），例如对抗多重耐药病原体和结核杆菌的抗菌活性（Li等，2021；Morehouse等，2023），以及抗病毒活性（Lacerda等，2022）。内生真菌还能产生抗癌药物，这些药物最初是从植物中发现的（Bhalkar等，2015；Doan等，2024）。Clonostachys rosea（曾被称为Gliocladium roseum）是一种常见的腐生丝状真菌，广泛存在于土壤和植物相关环境中。作为一种菌寄生菌，C. rosea具有对抗线虫、昆虫和植物病原真菌的生物防治潜力（Nagaraj和Kolanthasamy，2025；Sun等，2020），例如对抗Fusarium graminearum（Gimeno等，2021）、Sclerotinia sclerotiorum（Rodríguez等，2011）和Bemisia tabaci（白粉虱）（Anwar等，2018）。关于C. rosea和Gliocladium roseum（C. rosea的旧称）的代谢产物文献研究表明，它们含有多种化合物类别，如抗真菌聚酮类（Fatema等，2018b）、杀线虫的环氧多硫杂环哌嗪类（Dong等，2005）、细胞毒性的吲哚生物碱（Jiang等，2021）、抗菌的线性萜类糖苷（Okuda等，2000）、黄酮类化合物chrysin（Parthasarathy等，2023）、抗菌的二萜类糖苷（Wang等，2023a），以及特殊的脂肪酸4-Me-6E,8E-十六二烯酸（Dias等，2015）。全球已有基于C. rosea的商用生物防治产品（Funck Jensen等，2021）。

在本研究中，我们从Morus alba根部分离出了内生真菌C. rosea SBP-A，并发现一种支链共轭脂肪酸4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1）（图1）是粗细胞提取物中主要的甘油三酯脂质成分。先前的研究已鉴定出4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1的甲酯衍生物2（图1）（Dias等，2015）。在用甲醇（MeOH）提取C. rosea细胞的过程中，¹H NMR谱分析显示存在4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1的甲酯2。我们推测，这种脂肪酸甲酯2是由C. rosea细胞中的脂肪酶催化甲醇与含有4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1的甘油三酯之间的酯交换反应生成的。为了验证这一假设，我们使用了乙醇（EtOH）、n-propanol、n-butanol和苯甲醇等醇类作为提取溶剂，结果确实得到了相应醇类的脂肪酸酯衍生物3-6（图1），从而证实了脂肪酶的酯交换活性。有趣的是，这种酯交换反应仅针对特殊的脂肪酸1，而不影响其他常见脂肪酸。当使用胺类作为底物时，C. rosea脂肪酶也表现出转酰胺化活性，生成酰胺衍生物7-9，但转酰胺化的底物特异性仅针对硬脂酸，而非特殊的脂肪酸1。如前所述，内生真菌是生物活性化合物的丰富来源，但目前尚未明确C. rosea的生物防治机制。因此，本研究探讨了特殊脂肪酸1及其衍生物2-9的细胞毒性，认为1的细胞毒性可能是C. rosea的生物防治机制之一。此外，先前的研究已证明1的甲酯衍生物具有细胞毒性（Dias等，2015），因此我们评估了本研究中报道的这些化合物的细胞毒性。我们评估了支链共轭脂肪酸1及其酯和酰胺衍生物2-9的细胞毒性，发现特殊脂肪酸1对正常肺纤维母细胞（MRC-5）具有显著的细胞毒性。

实验方法

一般实验程序

NMR谱是在Bruker AVANCE 400 MHz光谱仪上记录的（¹H NMR使用400 MHz频率，¹³C NMR使用100 MHz频率），或在Bruker AVANCE 300 MHz光谱仪上记录的（¹H NMR使用300 MHz频率，¹³C NMR使用75 MHz频率）。HRESI-MS谱数据使用Thermo Scientific（Q Exactive Focus）光谱仪获得。FT-IR谱使用Thermo Scientific Nicolet iS5光谱仪测量。C. rosea的冻干细胞生物质使用Labconco Freezone 4.5 L冻干机制备。

C. rosea SBP-A中的脂质组成及4-Me-6E,8E-十六二烯酸（1）的结构鉴定

从冻干的C. rosea细胞中提取脂质，并通过反相C₁₈柱色谱法纯化。使用己烷提取冻干的C. rosea细胞后，得到一种黄色粗油（干菌体的重量占比为10.6%）。¹H NMR分析显示粗脂质提取物中含有甘油三酯的特征信号，特别是在δ_H 4.12和4.30 ppm处（补充材料，图S1）。此外，在δ_H 5.52处也有明显信号。

结论

我们分离出了内生真菌C. rosea SBP-A，并从中提取出了特殊的脂肪酸1。尽管之前已有报道指出1是一种真菌代谢产物，但其NMR数据尚未被公开；此前仅报道了其甲酯2。本研究提供了化合物1的NMR数据，证明甲酯2是C. rosea细胞中脂肪酶酶活性的产物。本研究证实了脂肪酶催化的酯交换反应。

作者贡献声明

Prasat Kittakoop：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、资金获取、数据分析、概念构思。Chulabhorn Mahidol：指导。Somsak Ruchirawat：指导。雷晓光：数据分析。Anongnuch Sasnarukkit：数据分析。Sanya Sureram：数据分析。Tawatchai Thongkongkaew：数据分析。Atchara Janthong：实验研究。Kraikrit Utama：实验研究。杨丹丹：初稿撰写、实验研究、数据分析。Padchanee Sangthong：

未引用参考文献

Wang等。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

数据获取

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

P. Kittakoop感谢泰国国家研究委员会（NRCT，合同编号N42A670689）、国家科学与创新基金（NSRF）以及泰国科学研究与创新机构（TSRI）的资助。本研究部分得到了环境健康与毒理学卓越中心（EHT，隶属于高等教育部、科学与创新部）和Chulabhorn研究所的资助（资助编号53503）的支持。