喀麦隆地区同时感染丙型肝炎病毒（HCV）的个体中近乎完整的人类Pegivirus 2（HPgV-2）基因组的特征分析

在喀麦隆HCV阳性血浆中发现6个HPgV-2完整基因组，系统发育分析显示其与全球毒株高度同源且遗传保守，填补非洲地区HPgV-2研究空白，证实主动基因组监测对区域公共卫生的意义。

　　

摘要

通过纳米孔宏基因组学技术，在HCV感染者的血浆中检测到了人类pegivirus（HPgV）基因组。共鉴定出6个几乎完整的HPgV-2基因组。系统发育分析确认了这些基因组的HPgV-2基因型。本研究揭示了共感染动态，突出了病毒的多样性，并为改进诊断方法提供了支持。

公告

人类pegivirus（HPgV）属于Flaviviridae科Pegivirus属，分为两种类型：HPgV-1和HPgV-2。HPgV-1（曾被称为GB病毒C或庚型肝炎病毒）是最常见的病毒类型，它是一种9.3 kb的单链正链RNA病毒，能够持续感染，但尚未发现其与肝炎或其他临床症状或疾病有关。HPgV-2较为罕见，常在HCV感染者体内被发现，不过目前也尚未证实其会导致肝脏疾病。

HPgV-2是一种新近发现的病毒，在基因上与HPgV-1有较大差异，与啮齿动物和蝙蝠中的相关pegivirus的氨基酸同源性不到32%。多个国家（包括美国、英国、德国、伊朗和中国）都报告过HPgV-2的感染病例。尽管HPgV-2在全球范围内分布广泛，但在喀麦隆的相关数据仍然有限，目前尚无来自非洲的完整基因组序列。本研究旨在通过利用喀麦隆HCV共感染者的完整基因组数据来填补这一空白。

本研究已获得当地伦理委员会（CRERSH/C E00571/CERSH/C/2023）的批准，对中非地区的人类pegivirus 2（HPgV-2）基因组进行了分析。研究对象为100份血浆样本，这些样本通过Abbott RealTime HCV检测方法（Abbott Molecular，美国）检测出HCV RNA阳性，病毒载量超过100 IU/mL，样本采集于2013至2023年间喀麦隆的雅温得。宏基因组分析发现了6例HPgV-2共感染病例。随后使用Quick-DNA/RNA病原体微量制备试剂盒（Zymo Research，美国）从每份样本中提取200 μL血浆，并用50 μL无DNase/Rnase的水进行洗脱，然后利用Sequence-Independent, Single-Primer Amplification（SISPA）方法（Oxford Nanopore平台，GridIon R10.4.1流式细胞仪）对病毒基因组进行测序；纯化的核酸经RNA Clean XP珠子（Beckman Coulter，美国）处理后，使用SuperScript IV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，美国）合成cDNA。逆转录过程中使用了特异性引物Sol-PrimerA（5′-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3′），该引物可随机结合到核酸模板上。随后使用Sequenase DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，美国）进行第二条链的合成。所得双链cDNA通过Phusion High-Fidelity DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，美国）和Sol-PrimerB（5′-GTTTCCCACTGGAGGATA-3′）进行PCR扩增。扩增产物使用Native Barcoding Kit（SQK-NBD114.24）构建SISPA文库，并在Oxford Nanopore Technologies的R10.4.1流式细胞仪（FLO-MIN114，英国牛津科学园）上按照制造商的协议进行测序。后续的生物信息学处理包括：使用Kraken2（v2.1.3）和MiniKraken2数据库（2019年4月版本）对纯化后的读段进行分类，结果通过Krona（DOI: 10.1186/1471-2105-12-385）可视化；病毒读段使用KrakenTools（DOI: 10.1186/s13059-019-1891-0）提取，并通过MEGAHIT（v1.2.9）（DOI: 10.1093/bioinformatics/btv033）进行de novo组装。每个样本的最长 contig 通过BLASTn（DOI: 10.1016/S0022-2836 (05)80360-2）与NCBI核苷酸数据库比对，选择最匹配的病毒参考序列，并使用viral-ngs环境中的assembly.py脚本（https://github.com/broadinstitute/viral-ngs）进行组装。通过参考选定的NCBI参考序列填补了文库中的空白部分，从而构建出用于比对的混合支架；纯化后的读段使用MiniMap2（v2.24）进行比对，再使用Medaka（v1.7.2）优化得到最终共识序列。根据优化后的比对结果计算了基因组覆盖深度和范围。最终获得了6个高质量、几乎完整的HPgV-2基因组（每个约9,000 bp），每个序列覆盖了GenBank中相应参考基因组的90%以上长度，平均深度为122倍，GC含量为58.5%。所有序列与已知HPgV-2参考序列的核苷酸相似度均超过90%（基于2024年4月的NCBI数据），其在多名患者中的检出表明该病毒在当地有活跃的传播。系统发育分析显示这些基因组与全球其他菌株高度一致（图1）。六种共识序列的特征在表1中列出。

图1

图1 基于GenBank中几乎完整的HPgV-2菌株基因组的系统发育树。图中标注了每个菌株的访问编号和来源国家。本研究中鉴定的菌株用黑色三角形（▲）标记。分支上的数字表示bootstrap值，仅显示了bootstrap值大于70%的菌株。多重序列比对使用MEGA 12中的MUSCLE算法完成，树谱构建采用了最大似然法和Kimura 2参数模型。数据来源于2024年4月的GenBank。

表1

表1 鉴定的六种HPgV-2基因组的特征

访问编号	采集年份	总读段数	G+C含量	基因组长度（bp）	平均深度（×）	最接近的GenBank参考序列	相似度%	来源国家/采样年份	SRA访问编号
PX313739	2016	714,247	59.6%	8,966	140	AB003291	91.69%	日本/1997	SRX31829865
PX693666	2016	601,245	59.7%	9,386	110	OQ791469	98.38%	尼日利亚/2023	SRX31829866
PX693667	2017	632,174	59.6%	9,381	120	KP710599	96.63%	尼日利亚/2017	SRX31829867
PX693668	2017	526,451	59.5%	9,378	100	KP710599	95.81%	美国/2015	SRX31829868
PX694297	2017	425,158	59.5%	9,371	80	KP710598	95.94%	美国/2015	SRX31829869
PX694298	2017	584,578	59.4%	9,387	110	KP710599	98.75%	美国/2015	SRX31829870

总之，本研究不仅描述了一种罕见的病毒，还展示了在非洲开展主动基因组监测的必要性。它填补了全球知识上的空白，同时增强了当地的能力，并为区域公共卫生提供了重要数据。

致谢

本研究未获得任何资助。

我们感谢喀麦隆巴斯德中心病毒学实验室的医学分析技术人员在样本采集和病毒载量测定方面的贡献，同时也感谢柬埔寨巴斯德研究所病毒学部门的宏基因组学和生物信息学分析工作。