从一名急性淋巴细胞白血病患者的粪便中分离出的携带blaIMP-1基因的Phytobacter ursingii OUH-01的基因组序列草图

碳青霉烯类耐药拟杆菌属ursingii OUH-01菌株基因组测序及特征分析，揭示其携带IMP-1碳青霉烯酶基因的质粒及物种鉴定依据。采用纳米孔测序与Illumina测序结合，完成5.7 Mb全基因组组装，包含3个质粒及4个线性contig。基因组注释显示5,813个编码序列，质粒pOUH-phyto-IMP-01携带IMP-1基因及整合子结构，与Serratia marcescens质粒具有高度相似性。物种界定通过GC含量、平均近缘性指数及双链破折点DDBH值综合验证。

　　

摘要

我们报告了从一名急性淋巴细胞白血病患者的粪便中分离出的耐碳青霉烯类抗生素的Phytobacter ursingii菌株OUH-01的5.7 Mbp基因组草图。该基因组包含1条染色体（G+C含量为53.5%）、3个质粒和4个线性contig，其中包含携带bla_IMP-1的222 kb质粒pOUH-phyto-IMP-01。使用Nanopore/Illumina测序技术获得了235倍的覆盖度。

公告

Phytobacter ursingii菌株OUH-01于2023年在日本冈山大学医院对一名急性淋巴细胞白血病患者进行发热性中性粒细胞减少症检查时从粪便样本中分离得到。该临床分离株已被匿名处理，冈山大学伦理委员会（IRB）认为其使用不构成人类受试者研究。通过CHROMagar mSuperCARBA（37°C，24小时）培养后，获得了提示为耐碳青霉烯类抗生素的Enterobacterales菌株的菌落，这些菌株的meropenem最低抑菌浓度（MIC）通过肉汤稀释法（CLSI M100）超过16 μg/mL（1）。改良的碳青霉烯类抗生素失活方法检测结果呈阳性，并且使用GeneXpert Carba-R（Cepheid）和Kaneka Carbapenemase Gene Detection Kit（Kaneka）均检测到了bla_IMP基因。MALDI Biotyper（Bruker Daltonics）鉴定该分离株为P. ursingii。此前关于Phytobacter属细菌获得C类碳青霉烯酶基因的报道极为罕见，全球仅描述了少数病例（2–4）。值得注意的是，其中一个分离株最初被鉴定为Metakosakonia massiliensis，后来被重新分类为Phytobacter属（5）。因此，我们对OUH-01进行了全基因组测序。

基因组DNA的提取方法参考了Moria等人的改进方案（6）：首先使用溶菌酶/无色肽酶处理脑-心灌流琼脂培养物（37°C，18小时）进行裂解，然后通过苯酚-氯仿提取。使用SQK-NBD114-24（Oxford Nanopore Technologies）制备的连接文库在PromethION FLO-PRO114M流式细胞仪上进行测序，读取数据使用Dorado v7.2.14软件进行碱基注释，共获得609,870条读段（93.36 Gbp）。另一个使用Illumina DNA Prep^(M) Tagmentation Kit（Illumina）构建的文库在NovaSeq6000上进行测序（2 × 151 bp），产生2,498,489对读段（0.74 Gbp），并使用fastp v0.20.1软件进行质量筛选（7）。通过Unicycler v0.4.8（8）进行混合组装得到4个环状contig；由于没有进一步的碱基校正，使用Pilon v1.24（9）进行了两次 polishing处理。环状contig自动旋转至累积GC偏斜值最小的位置，但该位置与< />基因座不一致。注释工作使用DFAST v1.6.0软件和标准参考数据库（“全模式”）完成（https://dfast.ddbj.nig.ac.jp/）。PlasmidFinder v2.1（10）将222.9 kbp的质粒分类为无法定型的Inc型质粒。除非另有说明，所有软件工具均使用默认参数运行。

最终得到的contig总长度为5,998,041 bp，包括1条染色体（5,697,787 bp，G+C含量为53.5%）和3个质粒：pOUH-phyto-24k（23,841 bp；G+C含量为61.0%）、pOUH-phyto-54k（54,506 bp；G+C含量为51.5%）以及pOUH-phyto-IMP-01（221,907 bp；G+C含量为53.0%）。另外4个contig未能形成环状结构。该染色体编码5,813个蛋白质编码序列、22个rRNA基因（8个5S、7个16S、7个23S）和85个tRNA。混合测序的覆盖度平均为235倍。

质粒pOUH-phyto-IMP-01携带嵌入在I类整合子（sul1-qacEΔ1-attC-bla_{IMP-1-attI1-intI1）中的blaIMP-1基因，该结构通常与转座事件相关（11）。BLASTn分析显示，该质粒与Serratia marcescens的Inc-untypable质粒p2020-O-9（GenBank登录号：AP024848.1）在220 kb范围内的同源性达到99.9%（12）；然而，OUH-01中的blaGES-5被blaIMP-1取代，这突显了该整合子的移动性。使用GGDC v3.0（13）对OUH-01的基因组序列（GenBank登录号：GCA_001022135.1）与P. ursingii进行dDDH分析，其同源性值为70.2%（95%置信区间：67.2%–73.1%），达到物种划分的阈值；结合GTDB（版本R214）的ANI = 96.14%和ΔG+C = 0.82%的结果，也支持将其分类为P. ursingii（14）。}

这些数据丰富了已知具有IMP基因的Phytobacter基因组库，并强调了环境中的Enterobacterales菌可能是质粒携带的碳青霉烯酶基因的隐藏宿主。