使用MinION纳米孔技术对大肠杆菌DH5α进行全基因组测序

《Microbiology Resource Announcements》：Whole-genome sequencing of Escherichia coli DH5α using MinION nanopore technology

Escherichia coli DH5α全基因组测序完成，采用DNeasy试剂盒提取DNA和MinION平台测序，组装出4583kb高质量基因组（GC 50.84%），含4542个基因及2个CRISPR阵列。

　　

摘要

我们提供了大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α的全基因组序列，该菌株是分子生物学研究中的重要实验菌株。我们使用Qiagen的DNeasy Blood and Tissue Kit和Oxford Nanopore MinION平台组装出了高质量的基因组（约4.58 Mb，鸟嘌呤-胞嘧啶[GC]含量为50.8%），从而揭示了其遗传结构和功能特性。

公告

大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，通常与温血动物相关，并且是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的核心成员（1）。该物种表现出显著的基因组和表型多样性，这是由于其对不同生态位的适应所形成的，进而导致了特定菌株的代谢能力和应激反应（2, 3）。这使得大肠杆菌成为研究细菌生理学、遗传学和进化的优秀模式生物。

大肠杆菌DH5α是一种广泛使用的实验菌株，源自K-12谱系，并经过改造以实现高效克隆（4）。其关键遗传特征包括lacZΔM15突变，这使得可以进行蓝白筛选；recA1和endA1突变提高了插入片段的稳定性和质粒DNA的质量；hsdR17等位基因则允许高效转化甲基化DNA（4）。此前已有针对NEB 5-alpha的封闭基因组序列的报道，NEB 5-alpha是DH5α的一种商业化的fhuA2衍生物，可作为该谱系的参考（5）。然而，NEB 5-alpha属于专有的实验室衍生物，而非从常规培养物中分离得到的DH5α菌株。为了提供一个独立的长读长参考基因组，本研究对来自印度昌迪加尔微生物类型培养物保藏中心（MTCC 1652）的大肠杆菌DH5α进行了测序和组装。

细胞在37°C下、以200 rpm的速度摇动培养10小时后进行DNA提取。基因组DNA的提取使用的是Qiagen公司的DNeasy Blood and Tissue Kit，按照针对革兰氏阴性细菌的协议进行。在整个提取和文库制备过程中没有刻意进行DNA片段化处理，仅在常规移液和清洗步骤中引入了最小的机械应力。文库制备使用的是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109），测序则在MinION平台上使用FLO-MIN106流动池（R9.4.1）完成。使用AMPure XP珠子进行清洗，以保留全长度范围内的DNA片段，无需额外的大小筛选。读段获取和质量监控通过MinKNOW软件完成，高精度碱基调用及接头修剪则使用Guppy v3.4.4软件和dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg配置完成。

测序产生了81,605条读段，平均读段长度为10,380 bp，平均Phred质量得分为11.1，根据NanoPlot的评估，基因组覆盖率为93倍（6）。使用Unicycler v0.5.0（7）在仅支持长读长的模式下进行de novo组装，随后使用Racon进行了三轮优化处理。在组装过程中，Unicycler自动将环状染色体从dnaA基因处开始读取。进一步的共识序列优化使用Medaka v1.12.1（8）和r941_min_high_g306模型完成。基因组注释采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP）v6.10（9）进行。除非另有说明，所有生物信息学工具均使用默认参数。

最终组装得到的基因组是一个包含4,583,112 bp的环状染色体，鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为50.84%，且不含质粒。PGAP识别出4,542个基因，其中包括4,421个蛋白质编码序列和121个RNA基因。使用CRISPRCasFinder v4.3.2（10）检测到两个CRISPR阵列，其共识重复序列分别为GTGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACC和GAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACC，这些序列与大肠杆菌中保守的I-E型CRISPR重复序列一致（11）。

致谢

本研究得到了TCS研究奖学金计划（企业研究与创新项目）以及阿姆里塔·维什瓦·维迪亚佩塔姆（Amrita Vishwa Vidyapeetham）的支持。