揭示纳米级铜对PC12细胞的体外毒性作用：一种由铁死亡（Ferroptosis）驱动的机制

纳米铜（nano-Cu）对PC12细胞的神经毒性作用及铁依赖性细胞死亡机制研究。采用不同剂量（0-50 μg/mL）nano-Cu处理PC12细胞，通过CCK-8法检测细胞存活率，并评估氧化应激（ROS、MDA、SOD、JC-1），发现nano-Cu显著降低细胞活力和抗氧化能力，伴随氧化应激增强、脂质过氧化和线粒体功能障碍。通过检测ferroptosis相关标志物（GSH、GPX4、ACSL4等），证实nano-Cu诱导的细胞毒性与ferroptosis途径激活密切相关，为揭示纳米铜神经毒性机制提供新证据。

　　

张泽洲|李涛|高静|张在义|徐鹏娟

天津中医药大学中西医结合医学院，中国天津300193

摘要

最新研究表明，微小的铜颗粒，特别是直径在15至30纳米之间的纳米铜（nano-Cu），可能具有引发神经毒性作用的能力。为了深入研究纳米铜的细胞毒性影响，我们将PC12细胞（实验室中常用的神经元研究替代细胞系）暴露于不同剂量的这种纳米材料（范围从0到50微克/毫升）。细胞活力检测使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）进行。通过测量活性氧（ROS）的产生、丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性和线粒体膜电位（JC-1），评估了纳米铜在PC12细胞中引起的氧化应激水平。此外，通过测量谷胱甘肽（GSH）水平以及GPX4、ACSL4、FPN-1、TFR1、HO-1、Nrf2、COX2和FTH1的表达来筛选潜在的毒性机制。结果显示，纳米铜的暴露以浓度依赖的方式降低了细胞活力和抗氧化能力，同时伴随着氧化应激、脂质过氧化和线粒体功能障碍的增加。值得注意的是，与铁死亡相关的标志物表达水平发生了显著变化，表明铁死亡参与了纳米铜诱导的细胞毒性。这些发现为铁死亡在纳米铜介导的神经毒性中的作用提供了关键见解，有助于更深入地理解其潜在机制。

引言

纳米沉积技术已成为一个重要的研究领域，在医学、电气工程、制药和农业等多个领域展现出广阔的应用前景[1]、[2]。纳米颗粒是一种具有纳米级尺寸的材料，不仅天然环境中普遍存在，也可以通过人工合成或制造[3]。然而，尽管纳米材料带来了许多好处，但它们渗透生态系统的可能性引发了对其环境影响和对生物体潜在危害的担忧。因此，正在进行严格的研究以评估其毒性，旨在理解和减轻与其应用相关的任何风险[1]、[4]、[5]。

纳米铜（nano-Cu）作为一种金属纳米材料，在化工[6]、新能源[7]和光伏[8]等多个行业领域得到广泛应用。其显著的抗菌特性使其在生物医学领域得到广泛应用[9]、[10]、[11]。然而，纳米铜使用的增加也带来了新的挑战，如暴露风险。尽管纳米铜具有许多优点，但我们对它的毒理学和细胞机制的了解仍需进一步扩展。由于其超微小的尺寸（以纳米为单位），纳米铜可以通过多种途径进入人体，可能对目标器官产生毒理学效应[12]。研究表明，纳米铜颗粒会对神经系统造成损害[13]。PC12细胞在分化后表现出神经元特征，常被用作许多神经科学研究中的模型细胞。这些细胞在神经科学研究中经过了全面评估，以阐明脑疾病的病理生理机制，包括神经毒性、神经保护和神经分泌等方面的研究。

铁死亡是一种独特的细胞死亡形式，其特征是细胞内自由铁（II）的积累，这会引发氧化应激和脂质过氧化，最终导致细胞死亡[14]。铁死亡与许多疾病的发病和进展密切相关。大量研究表明，铁死亡在神经细胞损伤中起着关键作用，其中氧化应激在此过程中起着至关重要的作用[14]、[15]、[16]。它是纳米材料引起不良健康效应的主要机制之一。先前的研究表明，纳米铜可以在不同类型的细胞（如肾小球系膜细胞、足细胞和PC12细胞系）中诱导氧化应激[17]、[18]、[19]。

迄今为止，纳米铜与PC12细胞之间的相互作用及其对铁死亡的影响尚未得到充分研究。在这项研究中，我们利用PC12细胞来评估纳米铜引起的细胞毒性和铁死亡，从而揭示了纳米铜的神经毒性，并提出了一种潜在的策略来减轻纳米铜引起的神经损伤。

材料

纳米铜颗粒的纯度为99.9%，购自中国的Macklin Biochemical Co., Ltd.（CAS：7440-50-8）。DMEM培养基由美国的Gibco BRL提供，胎牛血清（FBS）则购自同样位于中国的Cyagen Biosciences（广州）有限公司。此外，Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂盒也购自中国的UElandy, Inc.。用于测量SOD、GSH和MDA的试剂盒则从南京 Jiancheng购买。

纳米铜的表征

显微镜图像显示，纳米铜颗粒呈粉末状，颜色从红棕色到黑色不等（图1）。透射电子显微镜（TEM）图像表明，这些纳米铜颗粒的平均直径在30至60纳米之间。随后，使用扫描电子显微镜（SEM）来评估纳米铜颗粒的表面形态。如图1C和D所示，这些纳米颗粒具有不规则的球形结构。

讨论

纳米材料因其超细的尺寸、表面效应和量子隧穿效应而受到广泛关注。它们在医疗设备、电子设备和涂层等领域具有潜在的应用价值。在医学领域，纳米材料一直是研究的热点，尤其是在肿瘤治疗和抗菌应用方面。纳米材料的小尺寸使它们能够穿透细菌细胞膜和形成生物膜的细胞外聚合物（EPS）。这种独特性

CRediT作者贡献声明

张泽洲：撰写——初稿，实验研究。李涛：撰写——初稿，验证，实验研究。高静：监督，数据分析。张在义：监督，资源管理，项目统筹。徐鹏娟：撰写——审稿与编辑，监督，资源管理，项目统筹，方法学设计，数据分析，概念构思。

资助

本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的特定资助。

利益冲突声明

作者声明与本工作无关的任何利益冲突。这包括但不限于可能影响本文所述研究的财务、个人或专业关系。

如果未来出现任何潜在的利益冲突，作者承诺会及时向相关方披露。