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本研究从白蜡树未成熟 cones 中分离出两种内生菌（Pantoea trifolii RIT-To-1 和 Pseudomonas sp. RIT-To-2），通过基因组测序和系统发育分析揭示其分类地位及与白蜡树互作关系。
摘要
我们报告了从白杉（Thuja occidentalis）的未成熟球果中分离出的两种细菌内生菌的全基因组序列。基于基因组的分类分析确定这些分离株分别为Pantoea trifolii和Pseudomonas属。这些基因组序列为研究植物-微生物相互作用以及内生菌在针叶树生殖组织中的作用提供了资源。
公告
北方白杉（
Thuja occidentalis）是一种常绿针叶树。其轻质且耐腐的木材非常重要，常用于制造需要接触水和土壤的产品（
1）。在这项研究中，我们成功分离并测序了与白杉未成熟球果相关的两种细菌内生菌。
白杉样本采集自缅因州Schoodic地区（坐标：44.345955, -68.056299），首先用20%的次氯酸钠溶液进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗两次。将未成熟的球果用无菌技术解剖后放入烧瓶中，置于含有胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）的培养基中，在28°C下以200转/分钟的转速持续振荡培养3天。之后将培养物接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板上，在相同条件下继续培养（不进行振荡），以便分离内生菌。经过72小时的培养后，通过平板划线法进行两次单菌落纯化，最终获得了两种形态独特的菌落。为了提取菌株的gDNA，将一个菌落接种到50毫升的液体TSB培养基中，在28°C下以150转/分钟的转速振荡培养48小时。
使用E.Z.N.A.细菌DNA试剂盒（Omega Bio-Tek，美国乔治亚州诺克罗斯）从25毫升的细胞培养物中提取细菌DNA，随后使用Nextera XT文库制备试剂盒（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行文库制备，并在Illumina MiSeq（配置为2 × 300 bp的测序）仪器上进行测序（启用仪器的默认接头修剪设置）。原始读段经过fastp版本0.23.2进行处理（
2），并使用SPAdes版本3.15.4进行
de novo组装成contigs（
3）。基因组注释通过NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline版本6.10自动完成（
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/）（
4）。使用FastANI版本1.33计算组装基因组与代表性基因组的成对平均核苷酸同一性（ANI）（
5）。为了构建系统发育树，使用GToTree版本1.6.41分析每个菌株的基因组（
5），该软件可以预测蛋白质组并识别一组保守的单拷贝细菌标记基因。这些标记基因被比对、连接后，使用FastTree版本2.1.11构建近似最大似然树（
6）。除非另有说明，所有软件均使用默认参数运行。
内生菌物种
Pantoea trifolii RIT-To-1和
Pseudomonas属RIT-To-2在近似最大似然树中分别聚类在其所属属内（
图1）（
6，
7）。此外，它们的基因组组装和注释统计结果符合其所属属的预期范围（
表1）。
Pseudomonas属被认为是一种促进植物生长的细菌和生物控制剂（
8，
9）。2023年，根据最佳序列匹配结果，NCBI最初将RIT-To-1菌株归类为
Candidatus Pantoea symbiotica。然而，随着
Pantoea trifolii MMK2
T基因组的正式描述，这一分类被修订（
10）。RIT-To-1菌株与
P. trifolii MMK2
T菌株的ANI为95.51%，支持将其重新归类为该正式物种。进一步分析显示
Candidatus Pantoea symbiotica与
P. trifolii MMK2
T之间的ANI为95.74%，表明它们属于同一基因组物种。
致谢
我们感谢罗切斯特理工学院（RIT）Thomas H. Gosnell生命科学学院（GSoLS）和理学院（COS）的持续支持。
