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层状双氢氧化物（LDHs）作为纳米载体在药物递送和免疫治疗中展现应用潜力。本研究通过共沉淀-热处理法合成八种不同金属组成的LDHs，评估其携带卵清蛋白（OVA）的负载效率和细胞摄取能力。实验表明ZnAl和MgAl LDHs的OVA负载效率超过80%，其中ZnAl LDH比商用铝佐剂多15%的负载量，且能更快速地被MCF-7乳腺癌细胞和脾细胞摄取。释放动力学显示LDHs具有缓释特性，48小时内铝佐剂释放82%的OVA，而ZnAl和MgAl LDHs分别仅释放65%和54%。这些结果凸显了LDHs作为新型纳米佐剂的潜力，其性能受金属组成调控，有望在肿瘤靶向治疗中发挥作用。
阿什塔米·贾亚库马尔（Ashtami Jayakumar）、克里斯蒂娜·库鲁维拉（Christina Kuruvilla）、玛吉·保罗塞（Maggie Paulose）、莉莉·沙弗（Lilly Schaffer）、帕斯蒂尼·库蒂吉·S·诺尼斯（Paththini Kuttige S. Nonis）、赫克托·A·卡尔德龙（Hector A. Calderon）、乌曼·K·瓦尔格塞（Oomman K. Varghese）、钱德拉·莫汉（Chandra Mohan）
印度喀拉拉邦特里凡得琅的斯里·奇特拉·蒂鲁纳尔医学科学与技术学院（Sree Chithra Tirunal Institute for Medical Sciences and Technology, Trivandrum, Kerala, India）
摘要
层状双氢氧化物（LDHs）是一种阴离子纳米级粘土，具有多种医学应用，包括药物递送、免疫疗法和癌症治疗。LDHs的层状结构及其正电荷表面使其能够作为生物分子装载和释放的纳米平台。然而，LDH的金属组成如何影响蛋白质封装效率、细胞摄取和释放动力学仍不清楚。我们评估了通过共沉淀和水热处理合成的八种不同LDHs的药物装载能力。这些LDHs被装载了卵白蛋白（OVA），并与商业佐剂明矾（alum）进行了性能比较。在测试的不同LDHs中，ZnAl和MgAl LDHs的OVA封装效率超过了80%，其中ZnAl LDHs的OVA装载量比明矾增加了约15%。ZnAl LDH-OVA和MgAl LDH-OVA样品比纯OVA或装载了OVA的明矾更容易且更快地被MCF-7乳腺癌细胞和原代脾细胞摄取。大约82%的装载OVA在48小时内从明矾中释放，而ZnAl LDH和MgAl LDH在48小时内分别释放了65%和54%的装载OVA，表明它们具有持续释放的特性。
引言
层状双氢氧化物（LDHs）是一种二维粘土材料，其通用化学式为[MII1–xMIIIx(OH)2x+[An–x/n·yH2O，由带电的M(II)离子层和取代的M(III)离子组成。LDHs还可以表现出M(II)和M(III)离子的混合三元结构[1]。LDHs可以通过多种M(II)物种、M(III)物种和阴离子的组合来制备，从而提供可调的性质，扩展其功能。二价和三价离子的比例和组合对LDHs的性质起着关键作用。因此，通过选择不同的金属离子可以微调其性质。LDHs能够增加与带负电的细菌膜的相互作用，从而具有抗菌活性。带正电的金属离子层由阴离子和水分子稳定，这些阴离子和水分子作为客体分子存在于层间空间[2]。药物分子、抗原、生物活性分子和成像剂可以作为有效载荷掺入带正电的宿主层的层间空间，用于药物递送、免疫疗法、治疗或生物成像应用。
LDHs的独特功能使其在免疫疗法中具有吸引力。层内的高正电荷使其能够掺入阴离子抗原和生物活性佐剂。此外，它们的层间结构显著提高了装载效率[张T等人，2021年]。多项研究报告了LDHs作为疫苗纳米佐剂的潜力[3]、[4]、[5]、[6]。明矾是一种由氢氧化铝或羟基磷酸铝组成的商业佐剂[7]。文献表明，由于LDHs具有均匀的层状插层结构，而明矾的结构较为杂乱[7]、[8]，因此LDHs优于明矾。例如，MgAl LDH-抗原装载结构形成松散的组装体，并具有持续释放特性，在向抗原呈递细胞呈现抗原方面表现出更高的效率，能招募其他免疫细胞到目标部位并诱导所需的免疫反应[8]。LDH甚至可以作为非病毒载体，用于靶向递送RNA和质粒等遗传物质[9]，而不会导致遗传物质降解。这些发现强调了LDHs在个性化治疗策略和基因递送应用中的潜力。最近有报道指出，通过共沉淀合成的CoAl LDH通过离子交换显示出高水平的抗癌药物多柔比星（Dox）封装能力[10]。有趣的是，与正常细胞相比，装载了Dox的CoAl LDH在pH变化时表现出高装载能力和可控的药物释放，从而选择性地摄取肿瘤细胞并增加对癌细胞的毒性。邓等人报道了一种基于LDH的纳米递送平台，能够同时释放光热和化疗药物分子，实现精准的肿瘤靶向递送[11]。
尽管LDHs在装载感兴趣的生物分子方面具有潜在应用，但文献中缺乏关于不同组成LDHs的相对装载能力和释放动力学的信息。我们的工作通过全面比较各种LDHs的封装性能来填补这一知识空白。我们使用共沉淀和水热方法合成了八种不同的二元/三元金属LDHs，并研究了不同金属离子对所得LDHs的装载能力和封装效率的影响。我们将它们装载卵白蛋白（OVA）的效率与商业佐剂明矾进行了比较。OVA能够触发体液和细胞免疫反应[12]。由于LDHs带正电，它们可以通过静电相互作用装载带负电的生物分子，如蛋白质、核酸等[13]。带负电的OVA也可以通过静电作用装载到LDH上[14]。最具前景的LDHs被选用于进一步的癌症模型中的细胞摄取研究。
材料
使用了以下材料（供应商）：六水合硝酸锌（BTC chemicals，99%纯度）、六水合硝酸铝（Alfa Aesar）、六水合硝酸镁（99%，A.C.，Sigma Aldrich）、六水合氯化镁（BioXtra，Sigma Aldrich）、六水合硝酸镍（Alfa Aesar，98%）、六水合硝酸铜、六水合硝酸铁、氯化钙、氯化锌、六水合氯化铝（Sigma Aldrich）、NaOH（Macron Fine chemicals）、硫酸亚铁
LDHs的合成与表征
首先通过在冰上共沉淀金属盐来形成LDH核，然后在水热条件下生长这些核（图S1a）。本研究中制备的八种不同LDH的尺寸和外观如图S1b所示。扫描电子显微镜（SEM）图像展示了它们的形态（图S1c-j）。对反应条件的研究表明，LDH颗粒的形成和生长受到合成条件的影响
讨论
在低温下共沉淀会产生LDH的亚稳相。水热处理可以提高这一相的结晶度。在这项工作中，除了FeAl LDH外，所有通过共沉淀后进行水热处理的LDH都是结晶的（图S2）。图2C中的TEM图像显示了基面中原子的六角排列。这一层由金属离子（Zn2+和Al3+）与氢氧根离子（OH?八面体配位组成
结论
在这项工作中，通过成本效益高的共沉淀和水热处理合成的具有不同组成的LDHs被评估了它们的功能特性。MgAl LDH和ZnAl LDH在多个指标上优于临床批准的佐剂明矾。它们改进的封装和抗原装载能力可能与它们较高的表面积与体积比以及较大的层间间距有关
CRediT作者贡献声明
阿什塔米·贾亚库马尔（Ashtami Jayakumar）：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。克里斯蒂娜·库鲁维拉（Christina Kuruvilla）：可视化、方法学、正式分析、数据管理。玛吉·保罗塞（Maggie Paulose）：监督、方法学、数据管理。莉莉·沙弗（Lilly Schaffer）：方法学、数据管理。帕斯蒂尼·库蒂吉·S·诺尼斯（Paththini Kuttige S. Nonis）：可视化、研究、正式分析。赫克托·A·卡尔德龙（Hector A. Calderon）：撰写——审阅与编辑、可视化、数据
致谢
作者将本文献给已故的毒理学杰出科学家P. V. Mohanan博士。Mohanan教授是第一作者的博士导师，也是相应作者的合作者。
未引用的参考文献
[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：阿什塔米·贾亚库马尔报告称她获得了Fulbright US Scholar Program的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
阿什塔米·贾亚库马尔衷心感谢Fulbright委员会授予她Fulbright-Nehru访问博士奖学金，以便在美国进行研究。她感谢德克萨斯州休斯顿大学在她参加Fulbright项目期间的支持。H. A. Calderon感谢Instituto Politécnico Nacional（提案编号20243971）在休假期间的资助，以及SECIHTI（CVU 14392）和IPN的支持。作者们衷心感谢
