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本研究系统综述了化学引发剂激活微生物沉默BGCs的案例，构建了包含化合物-基因簇-天然产物的知识图谱，并探讨了其作用机制，以指导靶向激活策略，促进高效新天然产物发现。
周振毅|关宇天|李子阳|吴晓文|辛继祥|王红|魏斌
浙江工业大学药学科学与长三角地区绿色制药协同创新中心，中国杭州310014
摘要
系统基因组挖掘揭示了微生物编码了大量未被表征的次级代谢物生物合成基因簇（BGCs）。高效且选择性地激活这些沉默或隐性的BGCs对于高通量发现新型天然产物至关重要。最近的研究表明，使用小分子诱导剂是一种实用且经济有效的方法来释放微生物的次级代谢潜力。然而，目前的方法主要依赖于高通量、非靶向筛选方法来发现能够激活这些沉默BGCs的化学诱导剂。因此，本研究全面回顾了已报道的小分子激活沉默BGCs的案例，涵盖了诱导剂的化学结构、产生的天然产物以及目标BGCs，从而构建了一个综合知识图谱。我们还总结了其潜在的激活机制。利用该图谱中的关系，我们提出了利用小分子靶向激活沉默途径的方向，从而促进更高效的天然产物发现。
引言
新型天然产物的发现因其在结构上的多样性而具有重要的科学价值，这种多样性赋予了它们广泛的生物活性和应用范围，包括制药、食品、化妆品和营养保健品领域。随着下一代测序技术的进步和计算基因组挖掘的发展，天然产物的发现已进入了一个以基因组为导向的时代（Navarro-Mu?oz等人，2020；Ziemert等人，2016）。在这个时代，基因组数据被用来揭示微生物的次级代谢潜力，指导新型天然产物的发现（Harvey等人，2015）。许多基因组挖掘研究表明，微生物编码的生物合成基因簇（BGCs）中的大部分尚未被开发。例如，Gavriilidou等人估计，只有大约3%的细菌基因组中的天然产物得到了实验验证（Gavriilidou等人，2022）。我们最近的研究表明，海洋原核生物中的96.8%的次级代谢潜力仍未被探索（Wei等人，2023）。导致已鉴定天然产物与通过基因组挖掘发现的天然产物之间存在差距的主要原因是许多BGCs在实验室条件下处于沉默状态或表达水平较低，从而限制了这些潜在天然产物的生产和鉴定（Xu等人，2019）。
已经有许多策略被用来激活沉默的BGCs，从而从多种微生物中发现了新的次级代谢物。这些策略大致可以分为两类：刺激和遗传激活（Baral等人，2018；El-Hawary等人，2023；Mao等人，2018；Zong等人，2022）。刺激方法涉及使用外部因素来激活沉默的BGCs，而不改变生物体的遗传组成。这类策略可以进一步分为三种类型：化学诱导、生物诱导和环境扰动。当微生物在体外纯培养时，许多激活信号缺失，导致特定代谢物BGCs的表达下调。为了解决这个问题，可以与竞争物种共培养（生物诱导）或添加化学诱导剂（化学诱导）来诱导BGCs表达的变化（Rutledge和Challis，2015）。此外，改变环境条件（环境扰动），如营养水平、pH值或氧气供应，也可以刺激BGCs的活性（Romano等人，2018）。另一方面，遗传激活直接操纵遗传元素来诱导BGCs的表达。例如，可以操纵全局或途径特异性的调节因子（Lu等人，2017；Mao等人，2017；Otur和Kurt-K?z?ldo?an，2024），报告基因引导的突变体筛选（Mao等人，2018），重构（He等人，2024）和异源表达（Kang和Kim，2021）。然而，这些方法通常需要复杂的手动设计，并且成功率较低，特别是在异源表达中，因为化合物可能是通过多个基因簇的协同作用合成的（van Bergeijk等人，2020）。相比之下，化学诱导方法简单易操作且重复性好。近年来，高通量诱导剂筛选（HiTES）已被成功用于激活沉默的BGCs。HiTES可以使用多种检测方法，包括转录报告基因检测（Xu等人，2017），以及无需遗传学技术的生物活性检测（bioactivity-HiTES）（Moon等人，2019b），质谱检测（MS-coupled HiTES）（Covington和Seyedsayamdost，2021）和基于荧光共振能量转移的检测（FRET-HiTES）（Han等人，2023），从而能够在多孔板格式中高效地发现诱导剂。在过去十年中，化学诱导方法受到了广泛关注和应用。
在这篇综述中，我们专注于研究那些明确显示化学诱导剂能够激活沉默或低表达BGCs并产生隐秘天然产物的案例。我们注意到，在某些情况下，添加小分子会导致新结构类似物的发现，而不是真正激活沉默的BGCs。在这种情况下，添加的化合物通常作为代谢前体，从而改变已经活跃途径中的底物可用性。例如，用20种不同的蛋白质生成氨基酸喂养Streptomyces chartreusis NRRL 3882后发现，钙霉素的产生及其类似物的分布强烈依赖于氨基酸的供应，其中谷氨酰胺产生的钙霉素水平最高（Arend和Bandow，2021）。其他关于前体驱动产物生物合成调节的例子也在其他地方进行了回顾（Yan等人，2024）。尽管这些效应对于扩展化学多样性很有价值，但它们并不构成对转录沉默BGCs的激活，因此在本综述中不再进一步讨论。
虽然化学诱导剂的激活在概念上很简单，但有效诱导剂的鉴定仍然是一个重大挑战。目前的策略，如HiTES，可以高效地筛选大量化合物库，但主要是基于经验的，并缺乏坚实的理论基础。为了解决这一限制并实现更精确的诱导剂选择，我们首先基于文献中的数据构建了一个包含已知诱导剂的综合知识图谱，提供了一个结构化的知识基础。同时，我们回顾并总结了阐明BGC表达调控机制的实验范式，重点关注基于组学的调控网络。基于这两个基础，我们提出了一套指导小分子诱导剂合理选择的指南。通过这篇综述，我们旨在促进沉默BGCs的靶向激活，并最终促进新型天然产物的发现。
章节片段
化学诱导剂在激活沉默BGCs中的概述
已有数十种小分子被报道能够激活微生物中的沉默或表达不足的基因簇，从而产生新的天然产物。在这里，我们构建了一个包含32个BGCs的综合知识图谱，这些BGCs可以通过54种小分子诱导剂被激活或上调，进而合成或增加87种代表性次级代谢物的产生（图1 和 表S1）。这个知识图谱是根据已发表的文献手动整理的
诱导剂介导的BGC激活机制
全面理解BGCs的调控机制对于使用化学诱导剂靶向激活沉默的基因簇至关重要。由于BGC表达通常由复杂的、多层次的调控网络调控，基于网络的模型为解码这些过程提供了系统化的框架。这样的模型可以阐明不同调节因子之间的相互作用，从而为设计有效的诱导剂驱动策略提供理论指导
BGCs的靶向激活：诱导剂选择指南
基于综合知识图谱和上述的机制见解，我们提出了一套策略来指导诱导剂的选择，以实现沉默或低表达BGCs的靶向激活。这些策略并非确定性规则，而是基于生物信息学和化学信息学推理的知识驱动的启发式方法。鉴于不同微生物之间调控架构的多样性，真正实现BGCs的靶向激活并不总是可行的
结论与未来展望
总之，这篇综述重点介绍了当前使用化学诱导剂激活沉默BGCs的情况及其在发现新型天然产物中的目标应用。鉴于通过基因组挖掘揭示了大量未被表征的BGCs，策略性地使用化学诱导剂对于释放微生物的全部次级代谢潜力至关重要。我们构建了一个包含诱导剂–BGC–代谢物关系的综合知识图谱，并对其进行了分类
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号W2412100和42276137）、国家重点研发计划（编号2022YFC2804700和2022YFC2804104）、浙江省属高校基本科研经费（编号RF-A2022013）以及浙江国际科技合作自然产物开发利用基地的支持。
