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本研究开发了一种全自动KLK8免疫检测方法，并评估其在血浆中的性能。通过分析80例样本（对照组26例，MCI41例，痴呆13例），发现KLK8水平在MCI组显著高于对照组，且与神经丝轻链、tau蛋白及Aβ42/40呈显著正相关，提示KLK8可作为早期神经退行性疾病的生物标志物。
石田古普塔（Ishita Gupta）|三村雅弘（Masahiro Miura）|木村彩香（Ayaka Kimura）|田中沙耶香（Sayaka Tanaka）|武田修子（Shuko Takeda）|中岛恒夫（Tsuneo Nakajima）|桥本守（Mamoru Hashimoto）|岩田和彦（Kazuhiko Iwata）|濑川龙也（Tatsuya Segawa）|佐藤敏之（Toshiyuki Sato）|塩坂定夫（Sadao Shiosaka）
Sysmex公司中央研究实验室，日本兵库县神户市西区高塚台4-4-4，邮编651-2271
摘要
背景
早期诊断痴呆症对于在疾病进展到严重阶段之前及时进行治疗和管理至关重要。在这项研究中，我们旨在评估血浆中的Kallikrein-8（KLK8）作为轻度认知障碍（MCI）阶段早期诊断的潜在生物标志物的作用。
方法
我们使用自动化免疫分析系统HISCL
TM-5000开发了一种完全自动化的KLK8免疫测定方法，并对其分析性能进行了评估。利用该方法，测量了在大阪精神医学中心招募的80名受试者的血浆KLK8水平以及其他已建立的生物标志物——神经丝轻链（NfL）、tau蛋白（在苏氨酸181位点磷酸化的p-tau181）以及β-淀粉样蛋白（Aβ）40和42的水平。该队列包括26名对照组、41名MCI患者和13名痴呆症患者。
结果
新开发的完全自动化KLK8免疫测定方法使用30 μL的血浆样本即可表现出优异的分析性能。临床评估显示，MCI组患者的血浆KLK8水平显著高于对照组。相关性分析表明，KLK8与血浆中的NfL和tau（两者均为早期神经退行性病变的标志物）以及Aβ40的水平存在显著相关性。这些发现表明，KLK8可能作为MCI阶段早期神经退行性病变的预测标志物。
结论
因此，血浆KLK8水平可能用于预测痴呆症的早期阶段，并且是一种有前景的疾病预后生物标志物。
引言
痴呆症是一个日益严重的全球健康问题，目前全球有超过5500万人受到影响。据估计，每年新增病例达1000万例（世界卫生组织，2023年）。此外，与痴呆症患者相关的医疗护理、社会服务和照护所带来的全球经济负担预计将显著增加。大多数痴呆症的主要临床表现是认知障碍，这种障碍会逐渐恶化，在晚期导致严重的记忆丧失（Arvanitakis等人，2019年）。
轻度认知障碍（MCI）是正常衰老与痴呆症之间的过渡阶段，它与阿尔茨海默病（AD）和其他类型的痴呆症等严重的神经退行性疾病有关（Gauthier等人，2006年）。阿尔茨海默病是最常见的痴呆症类型，其特征是β-淀粉样蛋白斑块的积累和tau蛋白的过度磷酸化（Breijyeh和Karaman，2020年；Khan等人，2020年）。血管性痴呆（VaD）是第二常见的类型，其特征是脑血管病变（Roman，2003年）。在许多情况下，痴呆症涉及多种病理机制和临床症状的叠加。一些混合病理与主要疾病机制相关，而另一些则是偶然的或与年龄相关的（Cullinane等人，2024年）。在阿尔茨海默病中，病理性的神经纤维缠结最初出现在中枢神经系统的边缘系统区域，远早于临床症状的出现。这些病变逐渐从边缘系统区域扩展到新皮质。在Braak的边缘系统分期（III期和IV期），包括与记忆相关的脆弱脑区会受到影响，此时患者开始出现轻度认知衰退和细微的性格变化（Braak等人，1999年）。这一阶段被认为是MCI最早的病理指标之一（Stephan等人，2012年）。相比之下，仅根据淀粉样斑块的严重程度来区分正常衰老和MCI是具有挑战性的。研究表明，异常的斑块积累并不一定是从正常认知向MCI转变的必要条件（Stephan等人，2012年）。
KLK8，也称为神经素（neuropsin），是一种细胞外丝氨酸蛋白酶，表达在额叶皮质、边缘系统脑区和表皮组织中（Chen等人，1995年；Inoue等人，1998年）。在大脑中，其主要功能包括在记忆形成过程中调节神经可塑性以及调控与焦虑相关的行为。KLK8的激活依赖于神经活动，能够切割神经调节素-1（Nrg1）、Ephrin B型受体2（EphB2）和L1CAM的外域，从而触发边缘神经系统网络中的多种信号级联反应。这些级联反应有助于与记忆和抗压相关的行为（Attwood等人，2011年；Konar等人，2018年；Matsumoto-Miyai等人，2003年；Shiosaka，2022年；Tamura等人，2018年）。然而，这些生理功能可能会因神经系统功能障碍或神经退行性病变而受到干扰，导致KLK8水平异常升高（Herring等人，2016年；Shimizu-Okabe等人，2001年；Shiosaka，2022年）。KLK8在神经可塑性和记忆相关信号通路中的作用引起了人们对其在神经退行性疾病中作用的日益关注。
最近的研究表明，KLK8作为MCI和阿尔茨海默病（AD）这种最常见的痴呆类型的生物标志物具有诊断潜力。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）研究发现，MCI和AD组患者的脑脊液（CSF）和血浆中的KLK8水平均高于对照组（Teuber-Hanselmann等人，2020年）。此外，有研究报道在阿尔茨海默病患者的死后海马组织中KLK8 mRNA表达增加（Herring等人，2016年）。进一步的证据表明，通过抗体治疗或基因敲低来抑制升高的KLK8水平可以改善过表达含有瑞典/印第安纳突变的human amyloid precursor protein的转基因小鼠的类似阿尔茨海默病的症状，从而增强记忆功能（Herring等人，2021年；Schramm等人，2023年）。此外，还在其他类型的痴呆症中研究了KLK8：在血管性痴呆患者中发现的KLK8水平显著高于对照组（Li等人，2021年），在遗忘型MCI患者中也观察到了KLK8浓度的升高（Schramm等人，2023年）。这些发现表明，KLK8作为神经认知障碍临床诊断和预后的生物标志物具有潜力。
本研究的首要目标是开发一种完全自动化的KLK8免疫测定方法，以评估其作为MCI早期诊断血浆生物标志物的潜力。此外，我们还检测了在大阪精神医学中心招募的80名受试者的血液中的KLK8水平，以评估其在早期MCI检测中的实用性。为了将KLK8与常用的AD生物标志物（如神经丝轻链（NfL）、β-淀粉样蛋白（Aβ）40和42、tau蛋白（在苏氨酸181位点磷酸化的p-tau181）进行比较，我们使用了相同的血浆样本进行了相关性分析。
临床样本信息、研究批准和同意
受试者来自日本大阪的大阪大学医学院和大阪精神医学中心。该研究获得了这两个机构的伦理审查委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订案的伦理标准。所有受试者在入组前均提供了书面知情同意书。
临床性能评估
对于相关性分析，我们评估了15对脑脊液（CSF）和血浆样本...
完全自动化KLK8免疫测定方法的建立及其分析性能
单克隆抗体是使用重组人KLK8生成的，并根据其反应性和特异性进行筛选（详见“材料与方法”部分）。所建立的测定系统简单、高度可重复且快速，总测量时间为17分钟。
KLK8测定的标准曲线使用重组KLK8蛋白生成。6点校准曲线显示其动态范围为1 pg/mL至500 pg/mL。化学发光信号强度与...
讨论
在这项研究中，我们描述了在HISCL平台上开发的KLK8测定方法的性能。该测定方法在稀释线性、峰恢复和重复性方面表现出优异的性能。在15对样本中观察到脑脊液和血浆KLK8水平之间存在显著的正相关性，这与先前的研究结果一致（Teuber-Hanselmann等人，2020年）。在大阪精神医学中心收集的血液样本中进行的KLK8测量...
结论
在这项研究中，我们成功开发了一种完全自动化的KLK8免疫测定方法，用于定量血浆和脑脊液中的KLK8。该测定方法测得的KLK8水平在血浆和脑脊液之间显示出显著的相关性。此外，KLK8与已建立的神经退行性病变生物标志物（包括NfL和tau）相关，并且在MCI阶段表现出明显的升高，而不是随着疾病严重程度的增加而持续上升。这些发现突显了KLK8作为生物标志物的潜在用途...
术语表
不适用。
出版同意
不适用。
数据和材料的可用性
由于伦理限制，本研究中生成和/或分析的数据集不对外公开，但可根据合理请求向相应作者获取。
作者贡献
IG准备了原始草稿。IG和MM开发了KLK8的测定系统。AK、STak、TN、MH和KI收集了样本和信息。TSe开发了用于测定的抗体。IG、MM、STak和SS分析和解释了数据。MM、TSat和SS是本研究的概念设计和主要贡献者。所有作者均阅读并批准了最终手稿。
资金来源
本研究得到了Sysmex公司（日本神户）的资助。部分资金还来自大阪难治性疾病医学研究基金会的补助。
CRediT作者贡献声明
石田古普塔（Ishita Gupta）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析。
三村雅弘（Masahiro Miura）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、监督、正式分析、数据管理。
木村彩香（Ayaka Kimura）：方法学、正式分析。
田中沙耶香（Sayaka Tanaka）：方法学。
武田修子（Shuko Takeda）：方法学、数据管理。
中岛恒夫（Tsuneo Nakajima）：方法学、正式分析。
桥本守（Mamoru Hashimoto）：方法学、正式分析。
岩田和彦（Kazuhiko Iwata）：方法学、研究。
濑川龙也（Tatsuya Segawa）：
伦理批准和参与同意
该研究获得了大阪精神医学中心、大阪大学医院和Sysmex公司的伦理审查委员会的批准。研究遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订案的伦理标准。所有参与者均提供了书面知情同意书。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：IG、MM和TSat是Sysmex公司的员工。TSe是Immuno-Biological Laboratories公司的员工。其他作者声明没有利益冲突。
致谢
不适用。
