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自闭症谱系障碍模型中后天的丙戊酸暴露导致性别和脑区特异性突触蛋白改变及行为差异。
埃姆雷·图汉（Emre Tughan）|哈利梅·达纳（Halime Dana）|奥兹盖·努尔·伊尔马兹（Ozge Nur Yilmaz）|法特玛·科库姆（Fatma Kocum）|奇切克·德米尔鲁兹（Cicek Demiruz）|埃斯拉·德米尔吉（Esra Demirci）|埃利夫·丰达·塞纳（Elif Funda Sener）
埃尔吉耶斯大学基因组与干细胞中心（GENKOK），凯塞里，土耳其
摘要
丙戊酸（VPA）被广泛用于模拟自闭症谱系障碍（ASD）的表型；然而，产后暴露的发育时机和性别特异性分子后果仍不完全清楚。突触生成和突触蛋白动态的紊乱被认为是ASD神经生物学基础的核心。本研究调查了在关键发育窗口期（P30–P60）产后给予VPA后，行为和突触的变化是否依赖于年龄和性别。C57BL/6雌性和雄性小鼠在出生后第14天接受了一次腹腔注射VPA。行为评估包括社交互动、开放场测试、嗅觉偏好测试和Morris水迷宫测试。分子分析集中在海马体、前额叶皮层和嗅球中的突触后蛋白Neurogranin（Nrgn）和PSD-95（Dlg4）上。产后VPA暴露导致的行为变化依赖于年龄和性别，而非统一的缺陷。雄性在运动和社交参数上表现出更明显的调节，而雌性在空间学习测量中显示出相对的韧性。在海马体中，VPA导致1个月大的雄性Nrgn mRNA和PSD-95蛋白显著增加，表明在早期成熟过程中存在时间限制的突触重塑。这些分子变化具有区域特异性，并且是由相互作用驱动的，在前额叶皮层和嗅球中观察到的治疗效果有限。重要的是，蛋白质水平主要受年龄和性别的影响，而非治疗本身，这表明存在严格调控的发育调节，而不是持续的突触丢失。总体而言，这些发现表明产后VPA暴露以性别和区域依赖的方式扰乱了突触成熟的时间动态，突显了青春期海马体的脆弱性。结果强调了在ASD相关神经可塑性机制研究中纳入发育阶段和生物学性别的必要性。
引言
自闭症谱系障碍（ASD）是一种主要表现为社交沟通缺陷和存在受限、重复行为或兴趣模式的神经发育障碍。自闭症具有显著的遗传和遗传背景，涉及超过1000个相互作用基因（Hodges等人，2020年；Arta等人，2025年）。突触生成和异常神经连接的紊乱被认为是自闭症病因的基础（Hernandez等人，2023年）。除了遗传因素外，许多病例还受到环境因素的影响，如接触毒素、杀虫剂、感染和产前接触丙戊酸（VPA）（Landrigan，2010年；Moore等人，2000年；Roullet等人，2013年；Sandin等人，2014年）。
VPA用于治疗癫痫和双相情感障碍，以及预防人类偏头痛（G?ssowska-Dobrowolska等人，2020年）。子宫内接触VPA通常与ASD相关（Moore等人，2000年）。值得注意的是，啮齿动物对VPA暴露的关键窗口期与人类相似（Roullet等人，2013年；Silverman等人，2010年；Wohr和Scattoni，2013年）。许多研究表明，单次产前VPA暴露会导致啮齿动物的突触改变，从而产生与ASD核心表型密切相关的行为缺陷（Kataoka等人，2013年；Roullet等人，2010年；Schneider & Przewlocki，2005年；Nicolini等人，2018年）。
Neurogranin（Ng）是一种主要表达在大脑皮层和海马体锥体细胞中的小突触后蛋白。尽管其临床应用尚未完全确立，但Ng在长期增强（LTP）、突触再生和突触可塑性等关键神经过程中起着重要作用（Camporesi等人，2020年；Xiang等人，2020年）。这些功能通过钙和钙调蛋白依赖的信号通路介导（Huang等人，2004年）。在过去十年中，越来越多的研究集中在探讨Ng在病理机制中的潜在作用。这些研究表明，Ng表达或功能的改变可能导致几种神经发育和神经退行性疾病中的突触缺陷（Xiang等人，2020年）。条件性敲除Neurogranin的小鼠模型显示出空间记忆和突触可塑性的缺陷（Huang等人，2004年）。
在大脑中，PSD-95（突触后密度蛋白95）广泛分布，主要存在于突触后密度区。它与突触发育和可塑性有关，以及通过与谷氨酸受体等其他突触蛋白的相互作用来调节突触强度和可塑性（Osimo等人，2019年；Coley和Gao，2018年；Dutra-Tavares等人，2023年）。Psd-95敲除小鼠表现出与疾病核心特征相似的行为和分子表型（Feyder等人，2010年）。成熟小鼠的PsD-95寿命较长，而幼年小鼠的寿命较短。几乎所有脑区都显示出这种永久性的蛋白质寿命延长模式。单个突触中的PsD-95量在3到4周之间增加（Cizeron等人，2020年），表明PsD-95的合成必须超过其降解。然而，突触在此年龄迅速降解蛋白质，因此PsD-95的寿命最低。这意味着在断奶和独立生活开始之前，幼年小鼠的突触蛋白组合物不断构建和重塑（Bulovaite等人，2022年；Bonsi等人，2022年）。
本研究探讨了海马体、皮层和嗅球中与ASD相关的突触后蛋白。选择海马体、前额叶皮层和嗅球进行分析，是因为它们具有独特的发育轨迹以及与ASD相关的神经生物学相关性。这些区域在本文研究的产后期间经历了显著的突触重塑，每个区域都对ASD中经常出现的认知、执行和感觉领域有独特贡献。通过同时评估高级联想回路（海马体和前额叶皮层）和早期成熟的感官结构（嗅球），该设计能够全面评估产后VPA暴露引起的区域特异性和年龄依赖的突触变化。我们评估了不同发育阶段和脑区中的重复性和空间学习行为。选择PSD-95和Neurogranin（Nrgn）作为分析目标，因为它们代表了突触可塑性的关键标志物，整合了兴奋性突触成熟的结构和功能方面。据我们所知，此前没有研究系统地考察过P30–P60发育期间VPA模型中性别×年龄×脑区相互作用对突触标记物表达的影响。具体来说，当前文献中缺乏在两个产后阶段将Nrgn和PSD-95表达在多个脑区进行比较分析的内容。这一空白突显了我们方法的新颖性，并强调了在ASD模型中进行基于年龄和性别的突触分析的必要性。行为结果显示社交和重复行为显著减少。此外，我们观察到VPA处理过的雄性小鼠海马体中的Nrgn显著减少，以及雌性小鼠海马体和皮层中PSD-95表达的显著减少。
部分摘录
动物
所有实验程序均得到了埃尔吉耶斯大学动物伦理委员会的批准（协议编号23/053，日期2023年4月5日），并尽一切努力减少动物使用和痛苦。本研究中使用的小鼠由埃尔吉耶斯大学基因组与干细胞中心（GENKOK）转基因单元饲养和饲养，来自C57BL/6品系。动物在标准实验室条件下维持，温度为21–22°C，光照/黑暗周期为12小时（光照时间
产后VPA暴露后，运动活动、空间学习和嗅觉偏好的年龄和性别相关行为变化
在社交行为测试中，所有实验组雌性小鼠对陌生小鼠的兴趣都低于对照组雌性小鼠（图2A，B）。所有实验组雄性小鼠在社交互动区域移动的距离都比对照组雄性小鼠短，表明社交探索行为减少（图2C，D）。
在Morris水迷宫测试中，各组雌性小鼠的逃避潜伏期或游泳速度没有显著差异（图2E，F）。
讨论
VPA暴露不仅包括在自闭症患者中观察到的广泛行为改变，还涉及分子和遗传改变。VPA暴露的时间和剂量是ASD样行为结果的关键变量，这些结果在出生后早期（出生后8–14天）最为明显（Roullet等人，2010年；Roullet等人，2013年；Schneider & Przewlocki，2005年）。VPA模型是测试和开发新的行为和药物疗法的优秀工具（
未引用的参考文献
Harnett等人（2022年）。
CRediT作者贡献声明
埃姆雷·图汉（Emre Tughan）：撰写——原始草稿，资源，方法学，调查，正式分析。哈利梅·达纳（Halime Dana）：撰写——原始草稿，资源，方法学，正式分析，数据管理。奥兹盖·努尔·伊尔马兹（Ozge Nur Yilmaz）：方法学，正式分析。法特玛·科库姆（Fatma Kocum）：方法学，正式分析。奇切克·德米尔鲁兹（Cicek Demiruz）：方法学，正式分析。埃斯拉·德米尔吉（Esra Demirci）：撰写——审阅与编辑，数据管理，概念化。埃利夫·丰达·塞纳（Elif Funda Sener）：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，验证，监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢Vera Avc?在图形可视化方面的贡献。
数据可用性
数据将应要求提供。
资助
本研究得到了埃尔吉耶斯大学科学研究项目部的支持（项目编号：TYL-2023-12963）。
