《Cellular Signalling》：PIN1 suppresses bladder cancer progression by inducing cellular senescence and activating the interferon response pathway
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本研究通过单细胞RNA测序发现，PIN1在膀胱癌恶性上皮细胞中显著下调，与患者不良预后相关。恢复PIN1表达可抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡和衰老，并通过激活干扰素信号通路发挥抑癌作用。
张琳琳|陈聪|黄伟|董龙新|张继鹏|刘宝军|何伟阳
重庆医科大学第一附属医院泌尿外科，中国重庆400016
摘要
背景
膀胱癌（BCa）是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，具有高复发率和异质性的临床结局。尽管肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1（PIN1）已被证实是多种癌症的致癌基因，但其表达模式、生物学功能以及膀胱肿瘤发生的分子机制仍不甚明了。
方法
我们进行了全面的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，以表征BCa肿瘤微环境的细胞异质性并识别恶性上皮细胞。通过整合生物信息学方法，结合差异表达分析、生存相关性分析和细胞衰老关联研究，我们确定PIN1是一个关键的低表达基因。我们使用免疫组化、Western blot和qRT-PCR在临床样本和细胞系中系统验证了PIN1的表达。通过体外实验评估了PIN1调控对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和细胞衰老的影响。建立了异种移植小鼠模型来评估体内的肿瘤生长和衰老诱导情况。此外，还进行了RNA测序和通路富集分析以探索相关分子机制。
结果
与正常细胞相比，BCa肿瘤恶性上皮细胞中的PIN1表达显著降低。PIN1表达水平低与总体生存率（HR = 0.693，p = 0.0265）和无进展生存率（HR = 0.698，p = 0.0471）显著相关。PIN1表达升高显著降低了膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，同时促进了细胞凋亡和衰老。相反，PIN1的缺失加剧了恶性行为。体内研究表明，PIN1上调能够抑制肿瘤扩张并提高与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。机制上，PIN1过表达激活了干扰素反应通路，上调了包括IFNAR1、IRF7和IRF9在内的关键成分。拯救实验证实，阻断干扰素通路可部分逆转PIN1诱导的生长抑制和衰老效应，表明干扰素信号传导是PIN1肿瘤抑制作用的重要下游介质。
结论
我们的研究表明PIN1是一种先前未被发现的膀胱癌肿瘤抑制因子，它通过诱导细胞衰老和重新激活干扰素信号传导来抑制肿瘤进展。这项工作重新定义了该疾病的分子图谱，并将PIN1视为一个预后指标和未来治疗的潜在靶点。
引言
膀胱癌（BCa）是全球泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其特征是高复发率、严重的发病率和异质性的临床结局[1]。尽管手术精准度和多模式治疗不断改进，但对于肌肉浸润性或转移性患者的预后仍然不佳[2],[3]。因此，解码驱动膀胱癌进展的复杂分子机制以及发现新的生物标志物和可药物靶点仍然是当务之急。
肿瘤微环境（TME）是决定肿瘤命运的关键场所[4],[5]。这个复杂的生态系统——由癌细胞、免疫细胞、基质成分和细胞外支架相互作用组成——主动促进肿瘤发生、推动疾病进展并塑造治疗结果[6]。单细胞RNA测序（scRNA-seq）使研究人员能够逐个基因地解析这种细胞镶嵌结构，揭示每个功能亚群和罕见亚群，从而为识别TME中促进肿瘤发生的关键细胞亚群和分子驱动因素提供了新机会[7],[8]。在膀胱癌中，全面了解TME及其恶性细胞的转录程序对于理解疾病生物学至关重要。
细胞衰老是一种不可逆的细胞周期退出机制，可作为阻止受损或癌前克隆扩增的天然屏障[9],[10]。然而，这些衰老细胞可以释放一组细胞因子、蛋白酶和生长因子，统称为衰老相关分泌表型（SASP）。根据不同情境，这种分泌组可能重塑微环境，反而促进肿瘤进展，显示出衰老程序的双刃剑特性[11],[12]。衰老在癌症中的双重作用突显了识别决定其功能结果的关键调节因子的重要性[13]。因此，发现能够特异性诱导肿瘤抑制性衰老状态同时抑制有害SASP的分子是一种有前景的治疗策略。
肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1（PIN1）是一种专门的酶，能够催化磷酸化Ser/Thr-Pro肽键的构象转换，从而调节目标蛋白的功能、稳定性和定位，进而调控多种致癌蛋白和肿瘤抑制因子的构象、稳定性和功能[14]。PIN1表达升高是多种恶性肿瘤的常见特征，在这些癌症中它作为强大的驱动因素启动和促进肿瘤转化过程[15],[16],[17]。矛盾的是，其作用似乎取决于具体情境和癌症类型，有些研究提示其具有潜在的肿瘤抑制功能[18],[19]。然而，其表达模式、生物学功能及其调控的分子机制仍大部分未得到探索。
在这项研究中，我们首先对BCa及其匹配的正常邻近组织的scRNA-seq数据进行了深入分析，以绘制TME的细胞图谱。我们识别出恶性上皮细胞并揭示了它们的独特转录组特征。通过整合生物信息学方法，我们确定PIN1是恶性细胞中的一个关键低表达基因，该基因与良好的预后相关，并与细胞衰老有关。通过患者样本和培养细胞的靶向检测，我们确认PIN1在膀胱癌中始终处于低表达状态。功能验证——无论是在培养条件下还是在小鼠体内——均表明恢复PIN1表达可以抑制肿瘤扩张和扩散，同时促使恶性细胞发生凋亡和不可逆的衰老，从而证实该酶在这种背景下起抑制作用而非促进作用。机制上，我们发现PIN1通过调节衰老相关基因的表达以及激活干扰素反应通路来发挥其作用。
数据片段
scRNA-seq数据分析和细胞类型鉴定
膀胱癌scRNA-seq数据集GSE222315包含9个BCa样本和4个匹配的正常邻近组织（NAT）样本，从GEO数据库下载。使用R语言中的Seurat包（v4.0）进行了质量控制、标准化和聚类处理[20]。根据以下标准移除了不符合质量要求的细胞：独特分子标识符（UMIs）数量<500、表达基因数量<250或线粒体基因比例>10%。经过对数标准化后...单细胞RNA测序揭示了膀胱癌微环境的细胞异质性
为了描绘膀胱癌肿瘤微环境（TME）的细胞结构，我们分析了GSE222315数据集中的膀胱癌（BCa）样本及其匹配的正常邻近组织（NAT）的scRNA-seq数据。无监督聚类分析发现了27个主要细胞簇（图1A）。这些簇根据已建立的经典标记基因的表达进行了详细注释（图1B和C），包括T细胞（CD3D+、CD3E+）、B细胞（MS4A1+、CD79A+）等...
讨论
本研究采用多学科策略，整合了单细胞转录组学、生物信息学和功能实验，以阐明PIN1在膀胱癌中的表达谱、生物学作用和分子机制。主要发现包括：1）PIN1在膀胱癌恶性上皮细胞中显著下调，其低表达与患者预后不良密切相关；2）PIN1在体外和体内均表现出强烈的肿瘤抑制作用...
作者贡献
张琳琳：概念构思、方法设计及数据解读。陈聪和黄伟：数据分析。董龙新和张继鹏：图表制作。何伟阳和刘宝军：撰写初稿。所有作者均严格审阅了研究方案和手稿，并批准了最终版本。CRediT作者贡献声明
张琳琳：撰写——审稿与编辑、撰写初稿、资金申请、数据分析、概念构思。陈聪：方法设计、数据分析。黄伟：验证、软件使用、方法设计。董龙新：验证、资源获取、方法设计。张继鹏：软件使用、方法设计、数据管理。刘宝军：撰写初稿、资金申请。何伟阳：撰写——审稿与编辑。出版同意
所有作者均批准了最终版本的手稿及其在本期刊的发表。
伦理批准和参与同意
所有样本的获取均获得了伦理委员会的知情同意和批准（批准编号：2024-H074）。以下列出的动物实验方案已获得山东第一医科大学第二附属医院的伦理委员会批准（批准编号：2024-A042）。
资助
本研究得到了泰安市科技创新发展项目（2022NS202）、泰安市科技创新发展项目（2022NS218）、山东省医疗卫生科学技术发展项目（2019WS404）和山东省医疗卫生科学技术发展项目（202503111225）的支持。利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业、财务或知识产权关系。
