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泪液收集方法（TW、MC、SS）在蛋白质（SS最高471±222μg）、脂质（TW最高2.31±0.56AU）回收及白细胞分类（自动DxH计数更稳定准确）间的差异研究。
Justina Raouf Assaad | Pradipta Bhattacharya | Maria K. Walker
美国休斯顿大学视光学学院
摘要
背景
泪液（TF）的收集使得对眼表进行非侵入性研究成为可能。常用的方法包括泪液冲洗（TW）、微毛细管管（MC）和Schirmer试纸（SS），每种方法都有其优势和局限性。比较这些方法的结果取决于研究目的。本研究的目的是比较这三种技术在蛋白质和脂质回收方面的差异，以及自动化方法和手动方法在白细胞（WBC）分类方面的差异。
方法
从10名参与者处使用TW、MC和SS方法收集泪液样本。通过红外光谱法（Direct Detect，Millipore Sigma）测定总蛋白质和脂质含量。另外从9名参与者处收集TW样本，并比较自动化血液分析仪（DxH 500，Beckmann Coulter）、手动血细胞计数法（HEMO）和H&E染色法在白细胞分类方面的效果。分析方法包括混合效应分析、Bland-Altman方法、配对t检验或相应的非参数检验。
结果
总蛋白质含量最高的是SS样本（471 ± 222 μg），最低的是MC样本（88 ± 33 μg，P = 0.0004），TW方法介于两者之间（275 ± 215 μg）。总脂质含量方面，TW样本（2.31 ± 0.56吸收单位（AU）最高，其次是MC样本（0.04 ± 0.02 AU），SS样本最低（0.50 ± 0.19 AU，P < 0.001）。在第二项分析中，DxH分析仪测得的总白细胞计数（中位数；IQR）高于手动HEMO方法（603 cells/μL；范围327, 2365 vs 475 cells/μL；P = 0.004），BA偏差为?209 ± 209 cells/μL（LOA：?620至202 cells/μL）。DxH分析仪的变异系数显著低于HEMO方法（P = 0.02）。
结论
这些结果表明，不同泪液收集方法在蛋白质和脂质的回收量以及细胞分析方面存在差异，在设计相关研究时应予以考虑。SS方法能回收最多的蛋白质，而TW方法适合进行细胞分析。自动化血液分析仪（DxH）能够提供可重复的总白细胞计数结果。
引言
眼表的泪液（TF）具有多种重要功能，包括润滑、向眼表组织输送营养物质以及抵御入侵的微生物。泪液覆盖在眼表，不断暴露于环境因素（如过敏原、污染物）[1]和微生物威胁[3]中，因此富含抗菌蛋白（如乳铁蛋白、溶菌酶、细胞因子）以及数百种抗菌肽和免疫球蛋白，这些成分能够识别并破坏病原体[1][2]。此外，泪液中还含有免疫细胞，包括自然杀伤细胞（NK细胞）、中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞，它们会对潜在的微生物感染和炎症作出反应[4][5][6]。值得注意的是，这些免疫细胞在夜间泪液中的数量较多[4][7]，这可能是为了修复和恢复眼表组织，因为泪液会浸润角膜和结膜上皮，为其提供营养并反映免疫细胞的活动情况（如分泌物[8]）。泪液还含有脂质，有助于减少泪液蒸发[2]，以及其他多种支持性成分，如生长因子（如表皮生长因子EGF）[9]、抗氧化剂（如抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽）、电解质（如钠、钾、氯、碳酸氢盐、钙）和葡萄糖[10]。泪液通过提供物理屏障和丰富的免疫成分，保护并支持角膜和结膜组织，维持舒适度并改善视觉质量[2][11]。
在患有各种眼表和角膜疾病的患者泪液中，已经观察到多种炎症介质水平的改变，包括干眼症（DED）[8][12][13]、圆锥角膜（KC）[6][14]、眼移植物抗宿主病（GVHD）[15]、过敏性结膜炎（AC）[16]、眼瘢痕性类天疱疮（OCP）[17]和斯蒂文斯-约翰逊综合征（SJS）[17]。研究显示，IL-6[6][18][19]、IL-8[15]、MMP-9[21][22]等细胞因子和蛋白酶在DED和KC患者的泪液中水平升高；IL-8在GVHD中也升高[15]，IL-4和IL-5在AC中升高[16]；MMP-8和MMP-9在OCP和SJS中升高[17]。了解影响眼表的疾病中的泪液环境有助于深入理解疾病病理生理机制。
泪液的收集和分析是一种简单且非侵入性的方法，可用于研究眼表的分子和细胞动态。已经开发了多种收集技术，每种技术都有其独特的优缺点。最常用的方法是Schirmer试纸（SS）法，该方法将泪液吸收到纤维素膜中，然后可以洗脱出来以研究可溶性蛋白质和脂质[23][24]。虽然这种方法快速简便，但可能会刺激反射性流泪[25]，容易受到眼睑边缘的污染，并且可能无法捕获较大的不溶性成分（如细胞和某些脂质）。微毛细管管（MC）法直接从泪液弯月面将泪液吸入玻璃微毛细管中，能收集到更完整的样本，但收集过程较为困难，尤其是对于干眼症患者[23]。SS和MC方法在研究中应用广泛，便于不同研究之间的比较[23]。然而，这些方法可能会给患者带来不适，收集时间较长（最长可达5分钟[23]）。此外，这两种方法收集的泪液样本量相对较少，可能影响定量检测的准确性。泪液冲洗（TW）方法虽然不常用，但通过生理盐水冲洗后将样本收集到试管中[26][27]。该技术操作简便，能收集到包含细胞的大量泪液样本，但容易受到周围眼睑和附属组织的污染，导致泪液样本高度稀释。尽管已有许多研究比较了SS和MC等方法（包括基础泪液和冲洗泪液[28][29][30][31][32][33]），但在将这些常用方法与TW方法（唯一允许进行细胞分析的方法）进行详细比较方面仍存在知识空白，尤其是关于样本体积、总蛋白质和脂质含量以及细胞分析的数据。显然，这三种泪液收集方法各有优缺点，选择哪种方法通常取决于研究类型和预期结果。
有多种方法可用于确定生物液体样本中的细胞数量。传统上，血细胞计数（HEMO）是通过光学显微镜观察网格来手动计数细胞的。近年来，开发出了自动化血液分析仪，可以更快更高效地计数细胞[34][35]。一种常用的自动化分析仪（DxH 500，Beckmann Coulter）利用库尔特原理，根据颗粒通过小孔时产生的电阻脉冲数量和大小来计数和确定细胞大小。仪器通过同时检测阻抗（体积）和轴向光损失来区分细胞，然后由算法输出细胞数量和百分比[35]。这种自动化技术也可用于其他含有细胞的样本，如泪液。然而，泪液中的细胞在表型上可能与血液中的细胞不同[27]，因此在将此类仪器应用于研究之前，比较它们计数和区分泪液细胞的方式非常重要。
由于关于不同收集方法的泪液研究众多，比较这些方法有助于更好地了解它们的效率和实用性。本研究的目的是：（1）比较同一组受试者中使用不同泪液收集方法获得的蛋白质、脂质和细胞数量；（2）评估自动化血液分析仪在计数和区分TW样本中的免疫细胞方面的可行性。
方法部分
方法
本研究遵循了休斯顿大学机构审查委员会（IRB）于2021年9月9日批准的指南（参考编号：STUDY00003162），并遵守了《赫尔辛基宣言》的原则。所有受试者在自愿参与研究前均签署了知情同意书。所有参与者的隐私权得到了保护。本研究包括两项独立分析：第一项比较了三种泪液收集方法（TW、MC和SS）收集的总体积、蛋白质和脂质含量。
结果
在第一项分析中，从10名受试者（3名男性和7名女性）处收集了泪液样本，平均年龄为25 ± 2岁。
讨论
本研究系统地比较了三种泪液收集方法（TW、MC和SS）在样本体积、蛋白质和脂质含量以及细胞分析适用性方面的表现。尽管已有许多研究比较了SS和MC这两种常用方法，但尚未将它们与新型的TW方法进行对比[29][30][31][32][33]。值得注意的是，TFOS DEWS II报告未提供蛋白质的数值分析结果。
结论
本研究全面比较了三种常用的泪液收集技术，每种技术根据研究目的具有不同的优势。TW方法适用于需要大量样本、细胞分析和总脂质/蛋白质回收量的研究；SS方法适用于分析物丰富的样本采集和泪液分泌量的评估；MC方法则能提供处理最少、高度浓缩的蛋白质样本，适合进行专门的生化分析。在评估泪液中的白细胞时，DxH分析仪表现出优异的性能。
资助信息
本研究得到了美国国立卫生研究院（P30EY007551）、UH-NRUF-国家研究大学基金-Walker实验室以及UH-Student Vision Research Support Grant 2023的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Rachel Redfern（OD，PhD）在实验中的支持。
