《PLOS Biology》：USP7 facilitates brain tumor survival upon glucose deprivation by regulating phosphofructokinase muscle-type nuclear translocation in mice
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在营养匮乏的肿瘤微环境中，癌细胞如何重编程代谢通路以维持生存是癌症研究的核心问题。本研究发现，在葡萄糖剥夺（Glucose Deprivation, GD）条件下，去泛素化酶USP7通过感知代谢物F-2,6-BP（Fructose-2,6-bisphosphate）水平下降，与磷酸果糖激酶肌肉型（Phosphofructokinase muscle-type, PFKM）相互作用，并去除其K615位点的单泛素化修饰。这一修饰变化促进了PFKM经由Importin 4（IPO4）介导的核转位。进入细胞核的PFKM与转录因子c-MYC互作，共同上调肉碱棕榈酰转移酶1B（Carnitine O-palmitoyltransferase 1 muscle isoform, CPT1B）的表达，从而激活脂肪酸氧化（Fatty Acid Oxidation, FAO）通路，为肿瘤细胞在葡萄糖缺乏时提供替代能量来源，最终支持胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）的发展。该研究不仅揭示了PFKM在糖酵解之外的促癌新功能，也明确了USP7抑制剂在GBM治疗中的潜在价值。
引言：肿瘤代谢适应与PFKM的非经典角色
癌细胞因其快速增殖的特性，对能量和营养物质，尤其是葡萄糖的需求显著增加，导致肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）常处于营养物质受限的状态。为应对此类代谢应激，癌细胞能够重编程其代谢通路，转而利用谷氨酰胺或脂肪酸等替代燃料来源。然而，癌细胞在代谢压力下切换至替代代谢通路的具体机制仍不清楚。磷酸果糖激酶1（Phosphofructokinase 1, PFK1）是糖酵解的关键限速酶之一，催化果糖-6-磷酸（Fructose-6-phosphate, F6P）转化为果糖-1,6-二磷酸（Fructose-1,6-bisphosphate, F1,6BP）。PFK1有三种亚型：血小板型（PFKP）、肌肉型（PFKM）和肝脏型（PFKL）。近年研究发现，PFKM的上调与多种实体肿瘤的进展和不良预后相关。更引人注目的是，PFKM被发现可定位于细胞核内，并与DNA损伤修复蛋白NBS1互作以维持基因组稳定性。但PFKM的核转位如何被调控，以及核内的PFKM是否参与营养应激下的肿瘤细胞生存，仍是未知领域。
结果
1. 核转位的PFKM在葡萄糖剥夺后维持肿瘤细胞生存
为探究PFKM在肿瘤细胞适应营养缺乏中的作用，研究对U87和U251人胶质母细胞瘤细胞进行了葡萄糖剥夺处理。亚细胞组分分析和免疫荧光染色结果显示，在葡萄糖剥夺后，PFKM（而非PFKL或PFKP）发生了向细胞核的转位。通过序列分析，研究者定位了PFKM上一个潜在的核定位序列，并通过突变关键氨基酸残基（R772、K773、R774）构建了NLS功能缺失的PFKM突变体。实验证实，该突变体在葡萄糖剥夺后无法进入细胞核，且表达此突变体的肿瘤细胞在葡萄糖剥夺后的存活率显著低于表达野生型PFKM的细胞。这表明，葡萄糖剥夺诱导的PFKM核转位对于维持肿瘤细胞在营养压力下的生存至关重要。
2. 核PFKM水平与GBM的恶性程度和预后相关
为了明确核转位PFKM的临床相关性，研究者对原发性GBM患者肿瘤组织进行了免疫组化分析。根据核PFKM染色水平将患者分为低染色组和高染色组。生存分析显示，核PFKM低表达患者的中位生存期为19个月，而高表达患者的中位生存期显著缩短至14个月。此外，对低级别（WHO II级）弥漫性星形细胞瘤和高级别（WHO IV级）GBM标本的分析表明，高级别肿瘤中的核PFKM水平显著更高。这些结果证实了核PFKM在人类GBM临床行为中的参与，凸显了其与肿瘤预后的关联。
3. PFKM K615去泛素化促进其核转位与GBM发展
蛋白质的亚细胞定位常受翻译后修饰调控。研究者发现，PFKM存在单泛素化修饰，且在葡萄糖剥夺后，此修饰水平降低。通过点突变筛查，他们确定K615是PFKM单泛素化的关键位点。与野生型相比，非泛素化突变体PFKM K615R在葡萄糖剥夺后表现出更强的核定位能力。更重要的是，表达PFKM K615R的肿瘤细胞在葡萄糖剥夺后存活率更高，并且在小鼠原位GBM模型中，表达PFKM K615R的肿瘤生长更快，荷瘤小鼠生存期更短。进一步机制探究发现，核转运受体Importin 4（IPO4）在葡萄糖剥夺后介导PFKM的核输入。PFKM的单泛素化修饰会阻碍其与IPO4的结合，从而抑制核转位。K615R突变体与IPO4的结合更强，这解释了其更强的核转位能力。
4. USP7对PFKM K615进行去泛素化
质谱分析发现，去泛素化酶USP7在葡萄糖剥夺后与PFKM发生相互作用。实验证实，敲低USP7几乎完全阻断了葡萄糖剥夺诱导的PFKM去泛素化。同时，USP7的敲低也显著抑制了野生型PFKM的核转位，但对PFKM K615R突变体的核定位无影响。相应地，USP7敲低会严重损害表达野生型PFKM的细胞在葡萄糖剥夺后的存活，而对表达PFKM K615R的细胞影响甚微。这些结果表明，USP7在葡萄糖剥夺后与PFKM相互作用，并催化其K615位点的去泛素化，从而促进PFKM的核转位和肿瘤细胞生存。
5. 药理抑制USP7可抑制脑肿瘤发展
上述发现提示，靶向USP7可能成为治疗GBM的潜在策略。在荷瘤小鼠模型中，使用USP7抑制剂P22077进行治疗，可显著抑制表达野生型PFKM的肿瘤生长并延长小鼠生存期。然而，P22077对表达非泛素化突变体PFKM K615R的肿瘤的抗肿瘤效果则大大减弱。这证实了USP7抑制剂的疗效依赖于PFKM，特别是其K615位点的去泛素化状态。进一步的体外实验结合遗传学敲低和药理抑制，证实了P22077主要通过靶向USP7发挥作用。
6. F-2,6-BP阻止PFKM与USP7的相互作用
代谢物如何调控USP7与PFKM的相互作用？研究者测试了多种PFKM的变构效应物，发现果糖-2,6-二磷酸（Fructose-2,6-bisphosphate, F-2,6-BP）能显著减弱葡萄糖剥夺后USP7与PFKM的相互作用。F-2,6-BP是PFKM最强的变构激活剂。实验证实，葡萄糖剥夺后，细胞内的F-2,6-BP水平大幅下降。补充外源性F-2,6-BP可阻断两者相互作用及PFKM的去泛素化；反之，使用PFK2抑制剂3PO降低细胞内F-2,6-BP水平，则能增强USP7-PFKM互作和PFKM去泛素化。深入研究发现，F-2,6-BP通过与PFKM结合，促进其形成活性四聚体构象，而二聚体形式的PFKM与USP7的相互作用更强。体外Pull-down实验证实，F-2,6-BP是通过与PFKM（而非USP7）结合来破坏两者的相互作用。因此，葡萄糖剥夺导致的F-2,6-BP水平下降，促使PFKM转为更易与USP7结合的二聚体形式。
7. PFKM与c-MYC互作以上调CPT1B表达和脂肪酸氧化
在葡萄糖剥夺下，胶质瘤细胞依赖哪条替代代谢通路生存？抑制剂实验表明，脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可显著降低细胞存活率，而谷氨酰胺酶抑制剂或磷酸戊糖途径抑制剂则无此效果，说明胶质瘤细胞在葡萄糖剥夺下依赖脂肪酸氧化生存。CPT1是脂肪酸氧化的关键酶，其中CPT1B的表达在葡萄糖剥夺后被特异性上调。研究发现，PFKM的敲低可消除此上调，而表达核转位能力更强的PFKM K615R可进一步促进CPT1B的表达和脂肪酸氧化活性。敲低CPT1B或用Etomoxir抑制脂肪酸氧化，均可消除PFKM K615R带来的生存优势。机制上，荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验表明，核内的PFKM能与转录因子c-MYC相互作用，并共同结合于CPT1B的启动子区域，增强其转录活性。PFKM K615R突变体与c-MYC的结合及其对CPT1B启动子的富集能力均强于野生型。
讨论
本研究揭示了PFKM在糖酵解之外的一项全新功能：在葡萄糖匮乏时，通过激活脂肪酸氧化促进胶质瘤细胞生存。其调控轴可概括为：葡萄糖剥夺 → 细胞内F-2,6-BP水平下降 → USP7与PFKM（二聚体形式）相互作用增强 → USP7催化PFKM K615去泛素化 → 去泛素化的PFKM经IPO4介导转入细胞核 → 核内PFKM与c-MYC互作，上调CPT1B转录 → 激活脂肪酸氧化 → 维持肿瘤细胞能量供应和生存 → 促进GBM发展。该研究不仅阐明了肿瘤细胞感知营养压力并切换代谢模式的精细分子机制，也首次将USP7、PFKM的核功能、c-MYC转录活性和脂肪酸氧化通路整合在一个统一的调控网络中。值得注意的是，核PFKM水平与GBM患者的肿瘤分级和不良预后显著相关，而USP7抑制剂在临床前模型中显示出良好的抗肿瘤效果，这为开发针对USP7-PFKM轴的新型GBM治疗策略提供了坚实的理论依据和令人期待的前景。
