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本文系统综述了近年来cryo-EM单颗粒分析（SPA）解析膜蛋白高分辨率结构的主流两亲性环境，揭示了当前以去垢剂（尤其是GDN、MNG类）和蛋白基纳米盘为主流的趋势。文章深入探讨了各类环境（去垢剂、纳米盘、聚合物、肽基系统、脂质体、细胞来源囊泡）的优缺点，并指出非天然膜模拟物可能引入结构伪影的风险。最后强调，为准确解析膜蛋白的构象景观，需结合功能验证，并发展更接近天然膜环境的策略（如原位cryo-ET）以实现结构与生理功能的统一。
引言：结构解析的挑战与机遇
膜蛋白（MPs）是细胞生命活动的关键执行者，也是重要的治疗靶点。然而，将其从天然脂质双分子层中提取、稳定并解析结构一直是结构生物学领域的难题。低温电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）技术的崛起，极大地加速了膜蛋白结构解析的进程。不过，如何为膜蛋白提供一个既能维持其天然构象与功能，又适于cryo-EM成像的两亲性环境，仍然是核心挑战。本文旨在系统梳理当前主流的膜蛋白稳定策略，分析其应用趋势，并展望未来更接近天然环境的解决方案。
两亲性环境在玻璃化步骤中的应用概览
近年来，解析出分辨率优于3 ?的膜蛋白cryo-EM结构数量持续增加。对2023年至2025年6月间发表的1300份高质量结构报告的分析显示，应用最广泛的几类两亲性环境是：糖基洋地黄皂苷（GDN，占23%）、麦芽糖苷-新戊二醇（MNG）家族去垢剂（约20%）、蛋白基纳米盘（约18.5%）、单链烷基麦芽糖苷去垢剂（约15%）以及混合去垢剂（13%）。历史上在cryo-EM中广受欢迎的地高辛（Digitonin）使用频率已显著下降，目前占比不足5%。
从2020年到2025年的趋势分析（图2）进一步揭示了动态变化：MNG家族去垢剂（特别是LMNG）应用广泛，并常与其他去垢剂（如GDN）混合使用，尤其是在G蛋白偶联受体（GPCRs）的研究中。蛋白基纳米盘和麦芽糖苷去垢剂（如DDM）的使用保持稳定，而地高辛则迅速被GDN所取代。胆固醇半琥珀酸酯（CHS）是一种常见的添加剂，主要用于稳定膜蛋白，但需注意其可能对某些激素转运蛋白的结构解析产生干扰。
各类方法的优势与局限
去垢剂：去垢剂目前仍是玻璃化步骤中最常用的两亲性环境。传统上用于膜增溶和蛋白纯化，通常是初步成像测试的首选。通过使用接近临界胶束浓度（CMC）的浓度以减少脱脂，以及开发LMNG、GDN等更温和的去垢剂，已经能够在许多cryo-EM SPA模型中观察到脂质密度，这常被视为样品质量良好的指标。
蛋白基纳米盘：为在跨膜域周围提供更接近天然的脂质环境，常将去垢剂纯化的膜蛋白重构到基于膜支架蛋白（MSPs）或Saposin A的蛋白基纳米盘中。然而，越来越多的研究表明，MSP的选择和纳米盘尺寸至关重要，因为它们可能施加横向压力，影响功能相关的构象状态。例如，线粒体转运蛋白ABCB10的ATP酶活性和调节响应就取决于纳米盘的大小。更大的MSP（如MSP2N2）可以最大限度地减少常用的小型MSP1D1引入的扰动，更好地模拟天然脂双层环境。尽管如此，即使是大型MSP基纳米盘仍可能产生微妙影响，已观察到MSP与膜蛋白之间的直接相互作用，这可能稳定跨膜螺旋的局部构象。
肽基系统：为了简化将膜蛋白重构到蛋白基纳米盘中的繁琐步骤，两亲性肽被开发出来。其中，肽盘（peptidiscs）与蛋白基纳米盘类似，需要去垢剂进行膜增溶，但其围绕膜蛋白跨膜域的组装不需要额外添加脂质。而Salipro等基于肽的系统，可以直接溶解生物膜，实现无需去垢剂的一步重构。这些方法较新，目前蛋白质数据库（PDB）中尚无基于此类无去垢剂肽系统的高分辨率结构。在我们的数据集中，仅有20个高分辨率结构使用了肽盘，其应用远少于传统的MSP基纳米盘（241个结构）。
两亲性聚合物：与常规去垢剂不同，聚合物无需存在于缓冲液中来维持膜蛋白的溶解性。最早用于cryo-EM SPA的两亲性聚合物是Amphipols，它曾助力解析首个TRPV1通道的高分辨率结构。Amphipols（如A8-35或PMAL-C8）通常在膜蛋白用去垢剂纯化后使用，而苯乙烯马来酸酐（SMA）共聚物则允许直接溶解膜，形成被称为“天然纳米盘”的结构，其通常能保留部分天然脂质。尽管潜力巨大，但天然纳米盘在cryo-EM SPA中尚未达到预期的影响力。在我们的数据集中，Amphipols应用更广泛，产生了17-18个结构，而SMA仅产生1个。SMA共聚物的局限性（如对低pH和金属离子敏感、膜蛋白提取率较低、脂质交换快、难以忠实保持完整膜的物理特性如脂质堆积等）部分解释了这一结果。虽然已有新型聚合物被开发，但均未能完全克服这些限制。
更接近天然环境的策略：对去垢剂、两亲性聚合物甚至蛋白基纳米盘可能引起的结构变形的担忧，推动了对更能复制天然脂双层约束、保护膜蛋白构象景观的其他策略的探索。在脂质体中重构膜蛋白并进行cryo-EM SPA已获得高分辨率结构。脂质体比大型蛋白基纳米盘更能有效保持跨膜域的结构排列，也更适合捕捉机械敏感膜蛋白（如Piezo通道）的构象变化。对细胞来源囊泡和外泌体的cryo-EM SPA则更进一步，它更好地复制了膜的复杂性，同时避免了膜蛋白纯化。预计这种策略将在未来几年得到扩展，尽管小囊泡尺寸可能带来显著的膜曲率，影响某些膜蛋白的构象状态。
超越cryo-EM快照：走向膜蛋白的天然构象景观
虽然cryo-EM革命性地改变了膜蛋白结构生物学，但一个关键挑战依然存在：纯化后的膜蛋白在多大程度上保留了其天然构象景观？非天然膜模拟物（如约束性过强的支架）引入结构伪影的风险，对cryo-EM SPA模型在生物学上的相关性提出了重要问题。膜蛋白对其脂质环境高度敏感，其构象景观可因增溶策略的不同而发生显著改变。以细菌转运蛋白MsbA为例，其采用不同的内向（IF）构象取决于所使用的去垢剂或膜模拟物，一些两亲性环境有利于更宽的内向开放构象，而另一些则稳定较窄的构象。
因此，在人工系统中获得的结构可能捕获了稳定但非功能的状态，或未能捕捉到活性所必需的瞬时中间态。这一效应在高度动态的转运蛋白（如MsbA和OCT1）中尤为明显，但也影响动态性较低的膜蛋白，如α1甘氨酸受体。类似地，对于TMEM16 scramblase，不同构象状态的颗粒比例强烈依赖于用于纳米盘重构的MSP-脂质组合。这些影响在α螺旋膜蛋白中差异很大，但在β桶蛋白中似乎不那么显著。因此，在同一研究中报道同一膜蛋白在不同两亲性环境中纯化或重构的多种cryo-EM结构变得越来越常见。这反映了人们日益认识到膜模拟物可以改变颗粒在不同构象状态间的分布。在此背景下，功能验证已成为区分生理构象与伪影不可或缺的严格过滤器。结构测定和功能测量应尽可能在同一膜模拟物中进行。对于转运蛋白和离子通道，结构测定最好在允许直接测量转运活性的脂质体或细胞来源囊泡中进行。在这些系统中，观察到的构象与生物学相关状态之间的对应关系会显著增强。并行地，细胞和生物化学读数（如电生理学、转运测定、基于FRET的构象传感器、EPR/DEER光谱、交联质谱等）为解释cryo-EM状态并将其与生理活动联系起来提供了必要的背景。
同时，该领域正坚定地超越静态快照，一系列新兴方法能够从cryo-EM数据重建连续的构象景观，并捕获离散3D分类不可见的结构转变。将高分辨率成像、功能测定和分子动力学（MD）模拟相结合的整合方法，正成为膜蛋白结构生物学研究的核心。
用于膜蛋白原位研究的cryo-EM展望
过去十年，cryo-EM SPA的进步，以及表面活性剂和膜模拟系统的多样化，极大地拓宽了膜蛋白结构生物学。然而，没有一种两亲性环境是普遍有效的，需要针对具体案例进行优化，以保持完整性、类天然状态和功能。关于两亲性环境诱导寡聚体解离、活性受限或非天然构象的报道，凸显了继续开发改进型去垢剂、聚合物和膜模拟支架的必要性。与此同时，将膜蛋白保留在其天然膜内的策略正受到越来越多的关注。在此背景下，原位cryo-EM（通过cryo-电子断层扫描结合子断层图平均实现）能够在生理环境中可视化膜蛋白，揭示脂质依赖性调控和在纯化系统中常被忽略的构象景观。
鉴于当前进展，膜蛋白的近原子分辨率原位重构似乎越来越可行，尽管特定膜蛋白在膜中的低丰度仍是主要挑战。重要的是，原位cryo-EM是补充而非取代SPA。SPA继续提供解释断层图和解析机制细节所需的原子模型，而原位cryo-EM则提供验证结构状态、识别纯化诱导的伪影以及表征超分子组织所需的生理学背景。这些方法共同塑造了膜蛋白结构生物学的下一阶段，使我们更接近于理解这些蛋白质在其天然膜中如何真正运作。
