《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Impaired testicular development in male offspring following gestational DEHP exposure: The role of macrophage-Leydig cell axis
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为解决环境内分泌干扰物DEHP导致隐睾症的具体机制不明，特别是对巨噬细胞-间质细胞互作影响不清的难题，研究者聚焦“巨噬细胞-间质细胞轴”，开展机制研究。结果发现DEHP通过下调巨噬细胞表面受体Trem2，进而抑制Mical1/Erk1/2信号通路，导致睾酮合成不足，最终引发隐睾。该研究揭示了DEHP致隐睾症的新免疫调控机制，为防治提供了潜在靶点。
论文解读
在全球范围内，塑料制品的大量使用使得邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）成为一种广泛存在的环境污染物。它已被明确归类为一种具有生殖毒性的内分泌干扰物。一个令人担忧的临床现象是，约有1%至9%的足月男婴会患上隐睾症，即睾丸未能正常下降至阴囊，这是男性生殖道最常见的先天性异常之一。尽管有研究指出DEHP暴露与隐睾症发病率增加有关，但其背后精细的分子机制，特别是如何破坏睾丸内关键的细胞间“对话”，仍然是一个未解之谜。
在睾丸这个精密的“微工厂”里，除了负责产生精子的生精细胞，还有两类支持细胞扮演着至关重要的角色：一是合成雄性激素（主要是睾酮）的间质细胞（Leydig细胞），另一种是作为主要免疫细胞的巨噬细胞。在正常情况下，睾丸内的巨噬细胞呈现出抗炎的M2表型，它们与间质细胞紧密“握手”，通过分泌一些细胞因子，像“加油泵”一样支持间质细胞高效生产睾酮，从而保障睾丸正常下降和精子发生。然而，当有害物质入侵时，这种和谐会被打破。研究表明，DEHP在体内会代谢成活性更强的单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP），它可能促使巨噬细胞“变脸”，从温和的M2型转变为促炎的M1型，转而分泌炎症因子“攻击”间质细胞，抑制睾酮合成。但，MEHP究竟是如何对巨噬细胞“发号施令”的？这背后是否存在一个关键的信号“开关”？
为了回答这些问题，由叶松益、吴双、袁古通、徐杰、蔡博成、陈金铃和葛文亮组成的研究团队开展了一项深入研究。他们的研究成果发表在了环境与健康领域的重要期刊《Ecotoxicology and Environmental Safety》上。研究发现，孕期暴露于DEHP会显著下调雄性后代睾丸巨噬细胞中一个名为Trem2（髓系细胞触发受体2）的免疫调控受体表达，进而揭示了由Trem2、Mical1和Erk1/2三个分子构成的信号轴是连接DEHP暴露、巨噬细胞功能紊乱、睾酮合成不足直至最终导致隐睾症的核心通路。这项研究不仅为理解DEHP的生殖毒性机制提供了全新视角，也为预防和治疗相关男性生殖障碍提供了潜在的干预靶点。
关键技术方法概览
研究人员综合运用了体内动物模型和体外细胞实验来验证假设。动物研究方面，他们使用C57BL/6小鼠，在孕鼠特定时期（GD13.5-18.5）给予DEHP灌胃处理，构建了子代隐睾模型，并通过组织病理学、免疫荧光、蛋白质印迹(Western blot)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等技术评估睾丸发育、细胞数量和激素水平。体外研究则主要采用了小鼠巨噬细胞系RAW264.7和间质细胞系TM3，通过间接共培养体系模拟细胞间相互作用，并利用分子对接、蛋白质-蛋白质对接、RNA测序(RNA-seq)、小干扰RNA(siRNA)基因沉默、过表达、共免疫沉淀(Co-IP)和流式细胞术等技术，深入探究了MEHP的作用靶点及Trem2-Mical1-Erk1/2信号轴的具体调控机制。
研究结果
3.1. DEHP诱导C57BL/6小鼠发生隐睾并降低Trem2表达
研究人员首先在动物模型中确认了DEHP的生殖毒性。怀孕母鼠在胎儿睾酮合成的关键窗口期暴露于DEHP后，所生的雄性后代出现了睾丸未降的隐睾症。这些小鼠的睾丸和附睾系数降低，精子数量和质量下降，睾丸组织出现严重的生精上皮萎缩、空泡化等病理损伤。更重要的是，睾丸中间质细胞数量显著减少，与睾酮合成相关的关键蛋白（如StAR、CYP11A1、HSD3B1）表达和血清睾酮水平也明显下降。通过免疫荧光定位，他们发现Trem2蛋白特异性地表达在睾丸的巨噬细胞上，而在DEHP暴露后，其表达量显著下调。这初步将DEHP暴露、巨噬细胞Trem2减少、睾酮合成不足和隐睾症联系了起来。
3.2. Trem2基因沉默通过RAW264.7细胞加剧了MEHP对TM3细胞睾酮合成和增殖的损伤
为了弄清巨噬细胞如何介导DEHP的毒性，研究转向细胞实验。分子对接模拟预测，DEHP的活性代谢物MEHP可以直接与Trem2蛋白结合。在建立了巨噬细胞（RAW264.7）与间质细胞（TM3）的间接共培养体系后，他们发现MEHP处理不仅直接抑制TM3细胞的睾酮合成，当与巨噬细胞共培养时，这种抑制作用被进一步加剧。这表明活化的巨噬细胞放大了MEHP的毒性效应。进一步的实验发现，MEHP诱导巨噬细胞向促炎的M1型极化，并分泌更多的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。当利用基因工程技术降低巨噬细胞中Trem2的表达时，MEHP对间质细胞增殖的抑制更为严重；相反，激活Trem2则能恢复间质细胞的增殖能力。这证明了巨噬细胞上的Trem2在抵抗MEHP毒性、保护间质细胞功能方面扮演着保护者的角色。
3.3. 在RAW264.7细胞中过表达Trem2时，Mical1基因上调最为显著
接下来，研究团队试图寻找Trem2下游的关键执行分子。他们对过表达Trem2的巨噬细胞进行了RNA测序分析，在众多差异表达的基因中，一个名为Mical1（与CasL相互作用的分子1）的基因上调最为显著。后续验证实验确认了这一点，从而将Mical1锁定为Trem2潜在的关键下游靶点。
3.4. DEHP/MEHP通过Trem2-Mical1-Erk1/2信号轴调控巨噬细胞功能的机制
最后，研究者们系统阐明了这条信号通路如何工作。体内外实验一致表明，DEHP/MEHP暴露会同时抑制巨噬细胞中Trem2、Mical1和细胞外信号调节激酶1/2（Erk1/2）的蛋白表达。免疫荧光显示这三者在细胞内原本存在良好的共定位，而MEHP破坏了这种共定位。蛋白质-蛋白质对接分析从结构上预测了Trem2与Mical1、以及Mical1与Erk2之间存在直接相互作用的界面。功能获得和功能缺失实验完美印证了它们之间的层级关系：抑制Trem2会进一步加剧MEHP对Mical1和Erk1/2的抑制；而过表达Trem2则能逆转MEHP引起的Mical1和Erk1/2下调。同样，过表达Mical1也能恢复Erk1/2的水平。共免疫沉淀实验则直接证实了Trem2与Mical1、以及Mical1与Erk1/2之间存在物理结合。此外，当使用Erk1/2抑制剂处理与过表达Mical1的巨噬细胞共培养的间质细胞时，睾酮合成相关基因的表达被进一步抑制，这证实Erk1/2是直接影响间质细胞功能的下游效应分子。
结论与意义
综上所述，本研究描绘了一条清晰的有害物质致病的分子路径：孕期暴露于环境污染物DEHP → 其活性代谢物MEHP直接作用于睾丸巨噬细胞 → 抑制巨噬细胞表面受体Trem2的表达 → 进而下调其下游信号分子Mical1和Erk1/2 → 导致巨噬细胞向促炎的M1表型极化，炎症因子（如TNF-α）分泌增加 → 被扰动的巨噬细胞进而损害相邻间质细胞的功能，抑制其增殖和睾酮合成能力 → 最终因睾酮不足导致睾丸下降过程受阻，引发隐睾症。
这项研究的核心贡献在于首次揭示了Trem2-Mical1-Erk1/2信号轴是DEHP破坏睾丸巨噬细胞-间质细胞交互对话、导致隐睾症的关键免疫调控通路。它将环境毒理学、免疫学和生殖内分泌学紧密联系起来，为理解内分泌干扰物引起的男性生殖障碍提供了一个全新的机制框架。特别重要的是，研究发现激活Trem2可以缓解MEHP对间质细胞的损伤，这提示Trem2可能成为一个非常有价值的干预靶点。未来，针对此通路的保护性策略，例如开发Trem2激动剂，或许能为预防或治疗由环境污染物引起的隐睾症等男性生殖系统疾病带来新的希望。当然，研究也存在一些局限性，例如未能在动物体内进行Trem2基因回补或敲入实验来直接验证其治疗作用，也无法使用原代胎儿睾丸细胞进行共培养等，这些都为后续更深入的研究指明了方向。
