《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Nitrate reduction and iron (II) oxidation by subsurface bacteria from the Iberian Pyritic Belt: Insights into the biogeochemical cycles in this environment
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为探究极端环境下氮铁循环耦合机制及其生态功能，研究人员针对伊比利亚黄铁矿带（IPB）深部厌氧环境，以 Citrobacter telavivensis 和 Stutzerimonas stutzeri 为模式菌，系统研究了其硝酸盐还原能力（NRR）及硝酸盐依赖性亚铁氧化（NDFO）过程。研究揭示了在缺乏经典亚铁氧化基因的情况下，NDFO可通过异养-岩养混合机制（酶促硝酸盐还原为亚硝酸盐，随后亚硝酸盐非生物氧化亚铁）发生，并阐明了碳源类型、铁（II）浓度及胞外聚合物（EPS）在调控该过程中的关键作用。该研究为理解IPB等极端环境的生物地球化学循环及开发基于NDFO的生物修复技术提供了新见解。
在地球深处，隐藏着一些环境极端、生命却依然顽强存在的特殊生态系统。伊比利亚黄铁矿带（Iberian Pyrite Belt, IPB）便是这样一个地方，它横跨西班牙和葡萄牙南部，是世界上最大的金属硫化物矿床之一，尤以黄铁矿（FeS2）为主。源自此地的力拓河（Río Tinto）以其鲜艳的红色、强酸性（pH~2.3）以及高浓度的硫酸盐和重金属（如铁、锌、铬、砷）而闻名，甚至被视作研究火星环境的“地球化学类比体”。这片区域的深层地下环境黑暗、缺氧，却孕育着丰富多样的微生物群落。氮和铁是生命必需的关键元素，它们的生物地球化学循环深刻影响着生态系统的功能和演化。在IPB这样富含铁、硫的极端厌氧环境中，硝酸盐如何被微生物利用？亚铁离子（Fe(II)）的氧化过程又如何与氮循环相互耦合？这对于理解该地区独特的地球化学特征、黄铁矿的风化机制乃至潜在的地外生命环境都具有重要意义。然而，尽管对IPB的硫、铁循环已有较多研究，驱动其深部地下氧化还原转化的具体微生物机制，尤其是硝酸盐依赖性亚铁氧化（Nitrate-Dependent Ferrous iron Oxidation, NDFO）这一关键过程，仍知之甚少。
为了深入探究IPB深部地下环境中氮铁循环的耦合机制，以Joelithon de Lima Costa、José Manuel Martínez、Nuria Rodríguez、Fabrício Motteran、Lourdinha Florêncio、Mario Takayuki Kato、Ricardo Amils和José Luis Sanz为代表的研究团队，在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项研究。他们以从IPB深部地下（64米和414米深度）分离出的两株硝酸盐还原细菌——特拉维夫柠檬酸杆菌（Citrobacter telavivensis）T1.2D-1和施氏假单胞菌（Stutzerimonas stutzeri）T2.31D-1为研究对象，通过基因组学、批次培养实验和扫描电镜等技术，系统评估了它们的硝酸盐还原能力，并重点探讨了铁（II）在反硝化中的作用以及NDFO发生的可能性与机制。
为开展研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，对两株分离自IPB深部岩芯的细菌进行了基因组测序与分析，重点查找与反硝化、异化硝酸盐还原为铵（DNRA）及亚铁氧化相关的基因。其次，设计了严格的厌氧批次培养实验，使用基础矿物培养基，通过控制碳源（蔗糖、乳酸、乙酸）和亚铁离子（Fe(II)）浓度，系统评估了细菌单独及共培养时的生长、硝酸盐/亚硝酸盐消耗以及铁形态转化。实验设计采用了中心旋转复合设计以高效分析铁和碳源浓度对硝酸盐去除效率的影响。最后，利用扫描电子显微镜（SEM）结合X射线能谱（EDX）对培养结束后的细菌细胞进行了形貌观察和表面元素分析，以直观揭示铁在细胞表面的积累情况。
3.1. 基因组研究揭示硝酸盐还原潜能与亚铁氧化基因的缺失
通过对 Citrobacter telavivensis 和 Stutzerimonas stutzeri 基因组的分析，研究人员绘制了与反硝化和DNRA相关的关键基因图谱。分析表明，C. telavivensis 可以进行DNRA（拥有 nrfA 基因），但只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，无法完成完全的反硝化过程。相反，S. stutzeri 不具备典型的DNRA通路基因，但拥有进行完整反硝化所需的基因。一个至关重要的发现是，两株菌的基因组中均未发现与酶促亚铁（II）氧化相关的基因，这意味着它们不具备直接、酶促氧化亚铁的能力。
3.2. 碳源及与铁（II）的交互作用对硝酸盐还原的影响
实验评估了不同碳源（蔗糖、乳酸、乙酸）对细菌生长和硝酸盐消耗的影响。结果显示，无论是单独培养还是共培养，两株菌都能利用这些碳源进行硝酸盐还原。共培养体系在生物量生产上通常优于单独培养，体现了微生物间的协同作用。通过中心旋转复合设计实验，研究人员进一步解析了铁（II）浓度和碳源浓度对硝酸盐去除效率的交互影响。响应曲面分析显示，当使用蔗糖作为碳源时，铁（II）浓度的增加对硝酸盐消耗效率的影响较小，甚至在某些情况下（如对C. telavivensis）有正面影响。然而，当使用乳酸或乙酸时，较高的铁（II）浓度显著抑制了硝酸盐的消耗，这种抑制效应在 S. stutzeri 和共培养体系中尤为明显。
3.3. 铁（II）诱导的细胞表面结壳现象
为了解释铁（II）的抑制作用，研究人员通过扫描电镜观察了细菌细胞的形貌。结果清晰显示，在含有铁（II）的培养体系中，细菌细胞表面被大量的铁沉淀物所包裹，形成了一层“结壳”。能谱分析证实这些结壳富含铁元素。而在不含铁（II）的对照组中，细胞表面则相对光滑。这表明，铁（II）被（可能是非生物地）氧化为铁（III）后发生沉淀，并累积在细胞表面，这种物理性覆盖可能阻碍了营养物质运输和代谢活动，从而抑制了硝酸盐还原。
3.4. 氮形态转化与NDFO的证据
通过监测不同处理下硝酸盐、亚硝酸盐及其他氮形态（如铵盐）的变化，并结合铁（II）氧化的数据，研究为NDFO的发生提供了间接证据。特别是在 C. telavivensis 的培养体系中，观察到了显著的铁（II）氧化，同时伴随有硝酸盐的消耗和亚硝酸盐的积累或转化。由于该菌只能将硝酸盐还原至亚硝酸盐，且缺乏亚铁氧化酶，因此铁（II）的氧化很可能是通过化学途径实现的：即细菌酶促产生的亚硝酸盐（NO2-）非生物地氧化了铁（II），自身被还原为一氧化氮（NO）乃至氧化亚氮（N2O）。
综合以上结果，研究团队在讨论部分进行了深入阐释并得出结论。尽管两株IPB深部来源的硝酸盐还原菌 Citrobacter telavivensis 和 Stutzerimonas stutzeri 不具备直接的酶促亚铁氧化能力，但它们可以通过一种“异养-岩养”混合机制驱动硝酸盐依赖性亚铁氧化（NDFO）过程。其核心路径是：细菌以有机物为电子供体，酶促还原硝酸盐产生亚硝酸盐；随后，亚硝酸盐作为非生物氧化剂，化学氧化环境中的亚铁离子（Fe(II)），自身被还原为气态氮氧化物。这一过程在只能进行部分反硝化的 C. telavivensis 中尤为相关。
碳源类型在此过程中扮演了关键角色。蔗糖作为一种复杂碳源，可能促进了胞外聚合物（EPS）的产生。EPS可以包裹细胞，减轻铁沉淀物结壳带来的毒性，从而允许铁（II）通过上述非生物机制支持微生物代谢，表现为在蔗糖存在下，铁对硝酸盐还原的抑制效应较弱甚至有益。而乳酸和乙酸作为简单碳源，可能不足以诱导足够的EPS产生，使得铁结壳的负面效应占主导，抑制了硝酸盐还原。
从生态学意义上看，这些硝酸盐还原菌可能在IPB深部生物地球化学循环中发挥重要作用。即使没有直接的亚铁氧化基因，它们仍可通过三种方式贡献于黄铁矿的生物浸出：(i) NDFO过程产生的铁（III）对黄铁矿进行化学攻击；(ii) 代谢产生的有机酸溶解矿物；(iii) 尚未被阐明的其他机制。研究还指出，在IPB这个被喻为“巨大生物反应器”的极端环境中，微生物与矿物的相互作用是驱动元素循环和释放（如力拓河中高浓度铁和硫酸盐的来源）的核心动力。
该研究首次在IPB深部特异菌株中详细揭示了NDFO的潜在发生机制，强调了非生物化学过程在耦合氮铁循环中的重要性。这不仅深化了对极端厌氧环境生物地球化学过程的理解，也为开发基于NDFO原理的生物修复技术提供了新的理论依据和候选菌种，例如用于同时去除水体中的硝酸盐和重金属污染。论文通过整合基因组学、实验微生物学和微观形态学，为我们理解地球深部生命如何适应并改造其极端环境打开了一扇新的窗口。
