开发用于测定橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）中IL-10水平的夹心ELISA方法，并将其应用于病毒性出血性败血症病毒（VHSV）感染期间的蛋白质水平分析
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本研究针对橄榄石斑鱼开发IL-10单克隆和兔抗血清，建立敏感的夹心ELISA检测法，证实感染VHSV后脾脏、血清及腹水IL-10蛋白水平随时间递增，并与mRNA表达显著正相关，为鱼类IL-10免疫调控研究奠定基础。
Jin-Young Kim|Feberose Castro|Su-Mi Shin|Se Ryun Kwon|Sung-Ju Jung
韩国全南国立大学水生医学系
摘要
白细胞介素-10（IL-10）是一种具有抗炎作用的细胞因子，在维持免疫稳态中起着关键作用。尽管已有研究在硬骨鱼类中探讨了IL-10基因克隆、mRNA表达以及重组IL-10的功能，但在内源性蛋白质水平上的分析仍然有限。由于IL-10只有在以蛋白质形式分泌时才具有生物活性，因此直接检测和定量内源性IL-10蛋白对于准确阐明其免疫调节功能至关重要。在本研究中，我们制备了针对橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）内源性IL-10的小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体。利用这些抗体，我们建立了一种灵敏且特异性的夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）来定量IL-10。在感染病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的鱼类中，成功检测到了脾脏、血清和腹水中的内源性IL-10，并且IL-10水平在整个感染期间逐渐升高。此外，脾脏中的IL-10蛋白水平与mRNA表达呈强正相关。所开发的分析平台以及获得的蛋白质表达数据为进一步理解鱼类在病原体感染过程中IL-10介导的免疫调节机制奠定了重要基础。
引言
细胞因子是一类低分子量蛋白质，在调节免疫反应中起核心作用，它们在各种生理和病理情况下介导免疫细胞之间的信号传递，并诱导细胞存活、分化、迁移和激活[1]、[2]、[3]。根据功能不同，细胞因子被广泛分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子，每种类型通过抑制或调节另一种类型来维持免疫平衡（稳态）[3]、[4]。白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α和干扰素（IFN）γ是典型的促炎细胞因子，可诱导免疫激活以清除病原体[3]、[4]、[5]、[6]。而IL-4、IL-10、IL-13、IL-35和转化生长因子（TGF）-β则是抗炎细胞因子，能够抑制过度的炎症反应并防止组织损伤[3]、[4]、[5]、[7]、[8]、[9]。其中，IL-10被认为是最强大的抗炎和免疫调节细胞因子之一[9]、[10]、[11]。
IL-10最初被报道为由T辅助（Th）2细胞产生的细胞因子合成抑制因子（CSIF）[12]，它具有抗炎特性，能够抑制病原体感染期间发生的过度免疫反应，从而防止宿主组织受损[13]、[14]。IL-10由多种细胞类型产生，包括T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞[13]、[15]。分泌的IL-10通过与由两个不同链（IL-10R1/IL-10R2）组成的受体结合来发挥作用[13]、[16]。IL-10参与先天性和适应性免疫，调节免疫反应[17]。在先天免疫系统中，IL-10通过负调控炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的合成和一氧化氮的产生来抑制炎症反应[18]、[19]、[20]、[21]。在适应性免疫系统中，它促进B细胞和T细胞（CD8+）的增殖和分化[17]、[22]、[23]、[24]，并抑制Th1细胞分泌的细胞因子（IL-2、IFNγ）的合成[12]、[25]、[26]。
已在多种硬骨鱼类中报道了IL-10的存在，包括河豚（Fugu rubripes）[27]、普通鲤鱼（Cyprinus carpio）[28]、虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）[29]、斑马鱼（Danio rerio）[30]、海鲈鱼（Dicentrarchus labrax）[31]、金鱼（Carassius auratus）[32]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[33]、舌鳎（Cynoglossus semilaevis）[34]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[35]和鲶鱼（Ictalurus punctatus）[36]。鱼体内的IL-10由α-螺旋多肽组成二聚体[35]、[37]。在正常生理条件下，IL-10在大多数组织或免疫细胞中持续表达，在病毒或细菌感染或脂多糖（LPS）刺激后表达水平进一步上调[29]、[34]、[35]、[38]、[39]、[40]。功能分析表明，IL-10可以抑制单核细胞/巨噬细胞的呼吸爆发活性并下调炎症反应[32]、[34]、[41]。此外，IL-10还能促进B淋巴细胞分化，增强免疫球蛋白M（IgM）的分泌[35]、[42]，并刺激一部分CD8+记忆T细胞，同时下调CD4+记忆Th1型和Th2型反应[42]。以往关于鱼类IL-10的研究主要集中在序列和结构特征、mRNA表达分析以及使用重组IL-10蛋白的功能评估上。
与其他细胞因子一样，由于缺乏合适的抗体，鱼类中IL-10的蛋白质水平研究受到严重限制。因此，内源性IL-10的基本特性（如蛋白质表达模式（折叠、寡聚化、糖基化及分子大小）、浓度水平以及mRNA与蛋白质表达之间的关系）仍大多未知。这阻碍了我们对鱼类在病原体感染和疫苗接种过程中IL-10调节免疫反应机制的全面理解。为了解决这一限制，我们制备了针对橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）IL-10的单克隆和多克隆抗体，并开发了一种灵敏的夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）用于IL-10定量。这些抗体可通过Western blot、免疫沉淀和夹心ELISA特异性检测内源性IL-10。利用这些工具，我们进一步研究了感染病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的橄榄比目鱼中的IL-10蛋白表达情况。
实验方法片段
RNA分离和cDNA合成
使用RNAiso Plus（TaKaRa，日本）从橄榄比目鱼的脾脏中提取总RNA，然后用DNase I（TaKaRa，日本）处理以去除残留的DNA。使用NanoPhotometer N60（Implen GmbH，德国）测定RNA浓度，并根据制造商说明，从1,000 ng RNA开始使用ReverTra Ace? qPCR RT Kit（Toyobo，日本）合成cDNA。合成的cDNA在?20°C下保存直至分析。
抗体制备和鉴定
本研究中使用的重组蛋白的表达特性总结在表S1中。重组橄榄比目鱼IL-10蛋白通过E. coli（在pET-28a和pET-32a质粒中表达）和真核细胞（在pcDNA 3.1质粒中表达）表达系统成功表达和纯化。SDS-PAGE结果显示，每种重组IL-10蛋白（pET-28a、pET-32a和pcDNA 3.1）的预期分子量分别为25 kDa、37 kDa和25 kDa，包括标签蛋白（图1A）。
讨论
细胞因子介导的免疫调节对宿主防御至关重要，而IL-10是这一网络中的关键抗炎调节因子。尽管IL-10的重要性已被广泛认可，但由于缺乏可靠的细胞因子特异性抗体，直接检测和定量硬骨鱼类中的内源性细胞因子一直受到限制，大多数研究依赖于基因克隆、转录分析或重组蛋白分析[49]、[50]、[51]、[52]。在本研究中，我们制备了...
CRediT作者声明
Jin-Young Kim：概念构思、方法设计、软件开发、数据管理、可视化、写作 - 原始草稿。
Feberose Castro：实验研究
Su-Mi Shin：实验研究
Se Ryun Kwon：写作 - 审稿和编辑
Sung-Ju Jung：项目管理、概念构思、写作 - 审稿和编辑、监督、验证、资金筹集
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（2019R1I1A3A01063100）。
