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6PPDQ通过激活AhR/ROS信号通路引发脂质过氧化，导致斑马鱼胚胎期肠道损伤，揭示了其生态风险机制。
王哲|胡瑶|朱明军|杨新月|黄倩程|张安英|王新燕|周红
中国电子科技大学生命科学技术学院，成都，中华人民共和国
摘要
N-（1,3-二甲基丁基）-N'-苯基-p-苯二胺醌（6PPDQ）是一种源自轮胎橡胶的新兴环境污染物，据报道其在斑马鱼肠道中的积累水平高于其他组织，这引发了人们对肠道敏感性的担忧。然而，6PPDQ对胚胎发育期间肠道的潜在毒性仍不明确。本研究显示，暴露于6PPDQ（0.2-2000 μg/L）的斑马鱼胚胎表现出明显的肠道损伤，表现为肠道发红、肿胀、黏膜损伤和过度炎症。机制上，6PPDQ最初激活了芳烃受体（AhR）信号通路，进而导致活性氧（ROS）的过量产生。支持这一发现的是，AhR拮抗剂CH-223191和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸均能有效缓解6PPDQ引起的肠道损伤，从而证实了6PPDQ触发的AhR/ROS信号通路在此过程中的关键作用。此外，6PPDQ抑制了SLC7A11-GSH-GPX4抗氧化防御系统并提高了丙二醛水平，而CH-223191成功逆转了这些氧化失衡现象，表明AhR/ROS介导的脂质过氧化参与了6PPDQ引起的肠道损伤。进一步的研究表明，脂质过氧化抑制剂liproxstatin-1和ferrostatin-1也能有效改善6PPDQ引起的肠道损伤。总之，我们的研究结果表明，AhR/ROS介导的脂质过氧化通路参与了斑马鱼胚胎发育期间6PPDQ引起的肠道损伤，为了解6PPDQ对鱼类胚胎发育的潜在风险提供了新的见解。
引言
N-（1,3-二甲基丁基）-N'-苯基-p-苯二胺醌（6PPD-醌，简称6PPDQ）是一种源自橡胶轮胎磨损颗粒的新兴环境污染物[1,2]。监测研究表明，6PPDQ在全球多种水生生态系统中广泛分布，包括美国西雅图的城市径流（0.8-19 μg/L）[3]、香港的道路径流（2.43 μg/L）[4]、加拿大的唐河（0.29-2.35 μg/L）[5]以及中国柳溪河附近的地下水（平均：0.13 ng/L）[6]，这引发了对其对水生生物生态风险的担忧。最近的研究表明，6PPDQ的环境浓度对银鲑（Oncorhynchus kisutch）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、溪鳟（Salvelinus fontinalis）和帝王鲑（Oncorhynchus tshawytscha）具有致命性[3],[7],[8],[9]。然而，这种对6PPDQ的急性敏感性限制了对亚致死发育阶段的详细研究。相比之下，如斑马鱼（Danio rerio）这样的鲤科鱼类对6PPDQ具有较高的耐受性[10]，使其成为评估6PPDQ诱导的发育毒性和有机损伤的常用模型。特别是最近的研究指出，6PPDQ在成年斑马鱼的肠道中优先积累，突显了其潜在的肠道敏感性[11]。然而，6PPDQ对肠道的发育毒性仍大多未被探索。
肠道日益被认为是环境污染物的敏感靶标，氧化失衡被认为是污染物引起损伤的重要机制[[12],[13],[14]]。在此背景下，芳烃受体（AhR）作为一种经典的配体激活转录因子，在这一过程中起着关键的上游调节作用。配体结合后，AhR转移到细胞核中，与ARNT异二聚化，诱导细胞色素P450酶（包括CYP1A1和CYP1B1）的转录，导致活性氧（ROS）的过量产生[[15],[16],[17],[18]]。经典的配体如2,3,7,8-四氯二苯并二氧英（TCDD）激活AhR信号通路已被证明会在斑马鱼中引发心脏缺陷[19]。除了这一经典通路外，新的证据表明AhR激活还通过调节抗氧化防御通路来调控脂质过氧化。在慢性肾病（CKD）中，靛蓝硫酸盐（IS）激活AhR会抑制SLC7A11介导的半胱氨酸转运系统，从而损害谷胱甘肽合成，促进脂质过氧化并诱导铁死亡[20]。除了直接调节SLC7A11转录外，AhR信号通路还可能通过Nrf2影响其表达[21]。总体而言，这些发现表明AhR可能作为协调氧化还原稳态和脂质过氧化的调控枢纽。然而，AhR介导的脂质过氧化在6PPDQ引起的肠道发育毒性中的作用尚未阐明。值得注意的是，6PPDQ已被确定为斑马鱼中的潜在AhR配体[22]，这提示它可能通过AhR介导的氧化失衡损害肠道发育，从而促进ROS积累和脂质过氧化。
因此，本研究旨在评估6PPDQ在斑马鱼胚胎发育期间的肠道发育毒性，并探讨其潜在的分子机制。实验中，斑马鱼胚胎在受精后8至120小时（hpf）暴露于不同浓度的6PPDQ（0.2-2000 μg/L），以评估肠道的形态和组织学变化。进一步研究了AhR/ROS信号通路的作用，特别关注抗氧化系统的破坏和脂质过氧化。通过使用药理学抑制剂验证了AhR激活、ROS产生和脂质过氧化在6PPDQ诱导的肠道损伤中的作用。我们的研究结果表明，6PPDQ通过AhR/ROS介导的脂质过氧化通路引起斑马鱼肠道损伤，突显了6PPDQ的肠道敏感性，并为轮胎衍生醌的生态风险提供了新的见解。
化学物质和试剂
6PPDQ（CAS：2754428-18-5；纯度≥98.0%）购自山东沃德森生物技术公司（济南，中国），并将其溶解在DMSO中，最终浓度为2 mg/mL。CH223191（CH；HY-12684）、N-乙酰半胱氨酸（NAC；HY-B0215）、Ferrostatin-1（Fer-1；HY-100579）和Liproxstatin-1（Lip-1；HY-12726）均购自MedChemExpress（上海，中国），并分别溶解在DMSO中制备10 mM储备液。这些溶液分装后储存于-20°C直至使用。
6PPDQ在斑马鱼胚胎发育期间引起肠道损伤
为了研究6PPDQ对鱼类器官发育的影响，斑马鱼胚胎在受精后8至120小时（hpf）暴露于不同浓度的6PPDQ（0.2-2000 μg/L），这一时期是肠道形态发生和功能成熟的关键窗口。如图1A所示，6PPDQ剂量依赖性地增加了48 hpf时的胚胎孵化率，在200 μg/L和2000 μg/L浓度下孵化率显著升高（P < 0.05和P < 0.01）。此外，120 hpf时的幼体畸形率也有所上升
CRediT作者贡献声明
王哲：概念构思、研究设计、数据分析、写作。胡瑶：软件开发、方法学设计。朱明军：研究实施、数据管理、验证。杨新月和黄倩程：方法学设计。张安英和王新燕：写作 - 审稿与编辑。周红：概念构思、资金筹集、监督、写作 - 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。我们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
