Leadbeaterin-1的结构解析：这种主要来自Chrysochromulina leadbeateri的鱼类致死毒素 Chrysochromulina leadbeateri在挪威北部峡湾中大量繁殖

Xinhui Wang等人从2019年挪威北部有害藻华中分离的赤潮藻Chrysochromulina leadbeateri中鉴定出新型鱼毒 sterolysin类化合物 leadbeaterin-1，通过LC-HRMS/MS和NMR分析揭示其结构特征及与卡尔洛毒素的亲缘关系，并发现其不稳定酯化形式 leadbeaterin-5。定量NMR方法建立后证实该藻株中 leadbeaterin-1存在二异构体现象，且细胞内毒素积累存在微小差异。

　　

王新慧|安妮塔·索尔豪格|布鲁诺·C·加里多|伊丽莎白·M·马奇|马蒂亚斯·冯|亚伦·J·C·安德森|英格恩·A·萨姆达尔|本特·埃德瓦德森|夏洛特·H·戈特弗雷森|佩尔·尤尔·汉森|克里斯托弗·O·迈尔斯|托马斯·O·拉尔森

丹麦技术大学生物工程系，丹麦林比

摘要

2019年5月至6月，甲藻Chrysochromulina leadbeateri在北欧引发了迄今为止最严重的鱼类死亡事件。本研究报道了从C. leadbeateri中分离出一种新的鱼类致死甾醇裂解酶——leadbeaterin-1（1），并通过LC–HRMS/MS和NMR分析对其结构进行了表征。尽管leadbeaterin-1在结构上与karlotoxins相似，但它具有较少的双键、多醇侧链中的氯化基团，并且存在两种非对映异构体形式，这使其成为甾醇裂解酶类化合物中的一个独特成员。leadbeaterin-1与karlotoxin-2之间的密切结构相似性支持了Karlodinium和Chrysochromulina之间存在亲缘关系的观点。通过定量NMR（qNMR）技术，首次建立了真正的甾醇裂解酶定量标准，从而实现了对毒素的精确测量。实验结果表明，leadbeaterin-1对RTgill-W1（EC₅₀ 0.4 ± 0.1 μg/mL）和ASG-10（EC₅₀ 0.5 ± 0.1 μg/mL）鳃细胞系具有高度细胞毒性。出乎意料的是，在新鲜提取的样本中检测到了高比例的leadbeaterin-5（5），这种物质被鉴定为leadbeaterin-1的甘油酸酯；这种酯类衍生物不稳定，容易在采集和提取过程中转化为leadbeaterin-1。定量标准使得能够对UIO 035、UIO 393和UIO 394菌株中的C. leadbeateri样本中的leadbeaterin-1、leadbeaterin-5及其他相关化合物进行定量分析，发现其积累量存在细微差异。

引言

过去几十年里，挪威鲑鱼产业因有害藻华（HABs）而遭受了巨大损失。2019年5月至6月，在洛福滕地区的韦斯特菲约登（Vestfjorden）以及特罗姆瑟（Troms?）以北地区，Chrysochromulina leadbeateri大规模爆发，导致大量鱼类死亡（Karlsen等人，2019年；Marthinussen等人，2020年；Samdal和Edvardsen，2020年）。此次藻华导致约800万条养殖鲑鱼死亡（约14,500吨），对水产养殖业造成了严重影响。直接和间接损失估计达3亿美元（Marthinussen等人，2020年）。这一事件是挪威有记录以来最大的与有害藻华相关的鱼类死亡事件，也是北欧经济影响最严重的案例（John等人，2022年；Samdal和Edvardsen，2020年）。尽管此次事件规模巨大，但此前尚未从C. leadbeateri中鉴定或表征出任何鱼类毒素，因此无法理解其致毒机制，这凸显了进一步研究这些毒素的紧迫性。基于2019年期间对多个挪威峡湾进行的海洋采样分析，最近的研究表明，无机氮和磷酸盐的相对减少与参与内吞作用、溶酶体活性及多酮化合物编码基因表达的增加有关，这些变化可能与鱼类致死毒素的生物合成及混合营养方式有关（Otte等人，2025年）。2025年5月至6月，同一地区再次发生Chrysochromulina leadbeateri藻华，进一步凸显了了解这种藻类对鱼类毒性的关键性（Dalum等人，2025年）。

我们之前的研究利用虹鳟鱼鳃细胞系（RTgill-W1）的生物测定法和代谢组学分析，从2019年藻华中分离出的C. leadbeateri菌株中鉴定出一种潜在的鱼类毒素——leadbeaterin-1（1），该化合物含有67个碳原子和仅4个双键等价物（DBEs）（Wang等人，2024年）。还检测到了几种次要的leadbeaterin类似物（2–6），它们在氯化、氧化状态和硫酸化方面存在差异，表明这类化合物属于一个新的家族，我们将其命名为leadbeaterins（表1）。这些疑似鱼类毒素为长链线性化合物，富含氧基，结构上类似于karlotoxins和其他从甲藻中发现的甾醇裂解酶（Wang等人，2024年）。目前已报道了14种karlotoxin的同系物（Cai等人，2016年；Peng等人，2010年；Place等人，2024年；Rasmussen等人，2017年；Van Wagoner等人，2008年；Van Wagoner等人，2010年；Waters等人，2015年）。Karlotoxins如karlotoxin-2（7）（图1）具有独特的发夹状结构，由三个部分组成：一个多醇侧链（含有可变的羟基和甲基化基团）、一个含有两个吡喃环的铰链区域，以及一个以二烯结尾的亲脂性臂（Cai等人，2016年；Deeds等人，2015年）。亲脂性臂的长度似乎会影响这些化合物的溶血活性（Van Wagoner等人，2010年）。从致鱼毒性的甲藻Karlodinium veneficum中分离出的karlotoxin-2（Peng等人，2010年）已被证实会在有害藻华期间导致鱼类死亡（Deeds等人，2006年；Peng等人，2010年；Rasmussen等人，2016年）。

有研究表明，karlotoxins可能作为海洋生态系统中的化学防御机制对抗捕食者，也可能被K. veneficum用于麻痹猎物，便于捕获和吞食（Brown等人，2019年）。它们的作用机制可能与通过与特定甾醇结合破坏细胞膜有关，从而导致孔洞形成。这一过程归因于karlotoxins与双层膜中的甾醇相互作用时形成的发夹结构（Waters等人，2015年）。

本文报告了一种新的甾醇裂解酶leadbeaterin-1（1）的分离和结构解析，通过NMR对其进行了定量分析，并利用该定量标准评估了其对鱼类鳃细胞的毒性以及藻类培养物中leadbeaterins的积累量。同时，我们还发现了新鲜采集的C. leadbeateri样本中不稳定的酯化形式的leadbeaterins，推测这是leadbeaterins的主要释放形式。

材料

用于LC–HRMS的所有溶剂均为LC–MS级。结构解析的NMR光谱是在CD₃OD（99.96原子百分比氘）环境中记录的（Sigma–Aldrich公司提供）。

LC–HRMS分析

方法A：使用LC–HRMS监测C. leadbeateri提取物的分离过程。质谱仪为MaXis HD QTOF-MS（Bruker Daltonics公司，德国不来梅），配备电喷雾离子化源。质谱仪在正模式下运行，毛细管电压为3500 V，扫描范围为

leadbeaterin-1的分离与结构解析

为了获得足够的NMR分析样品（图S1–S10），我们对2019年藻华期间收集的C. leadbeateri菌株进行了大规模培养（110升）。通过多次富集步骤从上清液和细胞中分离出潜在的毒素leadbeaterin-1（1），最终通过半制备反相色谱法进行纯化。

对1进行HSQC NMR分析后发现，其碳信号数量超出分子预期

结论

2019年，有毒甲藻C- leadbeateri的爆发在挪威北部引发了大规模鱼类死亡事件。从2019年藻华中分离出的C. leadbeateri培养物中纯化出少量leadbeaterin-1（1，约300微克）。LC–HRMS和NMR分析表明，leadbeaterin-1是一种结构上与karlotoxin-2（7）相似的甾醇裂解酶。出乎意料的是，leadbeaterin-1以两种非对映异构体的形式存在，且色谱分离度较低。

CRediT作者贡献声明

王新慧：方法学研究、数据验证、实验设计、初稿撰写、可视化处理。安妮塔·索尔豪格：方法学研究、资源获取、实验设计、可视化处理、初稿撰写。布鲁诺·C·加里多：资源获取、实验设计、撰写、审稿与编辑。伊丽莎白·M·马奇：资源获取、实验设计、初稿撰写。马蒂亚斯·冯：实验研究。亚伦·J·C·安德森：资源获取、实验研究。英格恩·A·萨姆达尔：实验研究、资金筹集、撰写、审稿与编辑、项目协调。

使用的缩写

ASG-10：大西洋鲑鱼上皮鳃细胞系10；COSY：相关光谱技术；DBE：双键等价物；FS：全扫描；HMBC：异核多键相关；HSQC：异核单量子相关；LC–HRMS：高分辨率液相色谱-质谱联用技术；MS/MS：串联质谱技术；NMR：核磁共振；NOESY：核奥弗豪泽效应光谱；PRM：平行反应监测；qNMR：定量核磁共振；RM：参考物质。

CRediT作者贡献声明

王新慧：初稿撰写、方法学研究、数据分析。安妮塔·索尔豪格：资源获取、方法学研究。布鲁诺·C·加里多：撰写、审稿与编辑、资源获取、实验设计。伊丽莎白·M·马奇：撰写、审稿与编辑、资源获取、实验研究。马蒂亚斯·冯：实验研究。亚伦·J·C·安德森：资源获取、实验研究。英格恩·A·萨姆达尔：撰写、审稿与编辑、资金筹集。本特·埃德瓦德森：撰写、审稿与编辑、方法学研究。