编辑推荐：
为解决利用光镜监测有害藻类无法准确鉴定物种、与贝类中软骨藻酸(DA)积累相关性差的难题，研究人员开展了一项结合重组酶聚合酶扩增(RPA)与纳米孔测序技术，对伪菱形藻属(Pseudo-nitzschia)进行物种水平鉴定的研究。该方法成功应用于苏格兰和新西兰的环境样本，鉴定出13和17个物种，并证明有毒物种的相对丰度比属水平细胞计数能更好地预测有毒事件，为有害藻华(HAB)监测提供了快速、高分辨率的工具。
在广阔的海洋中，一种名为伪菱形藻(Pseudo-nitzschia)的单细胞浮游植物扮演着复杂的角色。作为硅藻的一种，它们本是海洋生态系统的基石，通过固碳、释放氧气和作为高等水生生物的食物来源，维系着地球生命的持续。然而，其中一些成员却隐藏着危险的秘密——能够产生一种名为软骨藻酸(domoic acid, DA)的神经毒素。这种毒素可以通过滤食性贝类、食浮游生物鱼类和海洋哺乳动物在食物链中富集。一旦人类或动物误食了被污染的 seafood，就可能引发失忆性贝类中毒(amnesic shellfish poisoning, ASP)或软骨藻酸中毒症，症状包括认知能力受损，特别是短期记忆障碍。为了保障公众健康，监管机构（如欧盟理事会）对贝类捕捞实施严格管控，包括监测水体中有毒藻类的数量。目前，常规监测主要依赖近一个世纪前建立的、由经过培训的分类学家通过光学显微镜进行人工计数的技术。这种方法不仅耗时费力，而且由于许多有害藻类（尤其是伪菱形藻）在形态上高度相似，难以精确区分到物种水平。而不同物种的产毒能力差异巨大，这导致常规的属水平细胞计数与贝类实际毒性之间常常缺乏良好的相关性。要准确鉴定伪菱形藻的物种，需要借助电子显微镜观察其硅质外壳的精细结构，这个过程对于日常监测来说过于漫长且不切实际。因此，开发一种能够快速、准确地对伪菱形藻进行物种水平鉴定的新方法，对于提升有害藻华监测预警能力、保护海洋生态和公众健康具有迫切需求。针对这一挑战，来自英国环境、渔业和水产养殖科学中心等机构的研究团队在《Harmful Algae》期刊上发表了一项创新性研究。他们巧妙地结合了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)和纳米孔测序(nanopore sequencing)技术，建立了一套高效、灵敏的检测流程，旨在揭示复杂环境水华中伪菱形藻的真实物种多样性，并评估其对预测贝类中毒事件的潜力。
为开展此项研究，作者们主要应用了以下几项关键技术方法：首先是重组酶聚合酶扩增，这是一种恒温DNA扩增技术，无需热循环，对抑制剂耐受性强，可进行快速、简化的核酸提取。其次是纳米孔测序，利用Oxford Nanopore Technologies公司的MinION设备，对RPA扩增产物进行实时、长读长测序，可在测序过程中初步判定物种组成。最后是生物信息学分析流程，包括利用Minimap2将原始测序读数与包含52种伪菱形藻和1种相关物种(Fragilariopsis oceanica)的定制参考列表进行比对，过滤后生成一致性序列，并进行系统发育分析以确认物种身份。研究样本来源于两个环境案例：一是2022年5月至2023年8月期间从苏格兰18个贝类捕捞区采集的37份卢戈尔氏液固定水样；二是2025年2月从新西兰8个地点采集的10份类似水样。
研究结果部分揭示了该方法的有效性及其在两个地区的应用发现：
3.1. 方法开发与性能测试
研究人员针对伪菱形藻核糖体DNA的ITS1“条形码”区域设计了特异性RPA引物。验证实验表明，该方法能正确鉴定13株参考培养物，灵敏度达到2500 cells L-1。体外分析显示该方法对几乎所有已知伪菱形藻物种（包括IOC-UNESCO有害微藻名录中列出的所有29种产毒物种）都具有良好的包容性，虽然可能同时扩增近缘种F. oceanica，但可通过参考列表进行识别和区分。系统发育分析证实，该方法能准确地将样本归类到正确的物种。
3.2. 文库制备、多重测序与测序
研究发现，适用于长片段（>500 bp）的快速转座酶测序试剂盒不适用于本研究产生的较短扩增子（230-350 bp）。因此，后续所有测序均采用连接法测序试剂盒(Native Barcoding Kit)，该方法虽耗时稍长（约6小时处理24个样本），但能获得全长扩增子序列，确保了数据质量。
3.3. 苏格兰环境案例研究
该方法成功应用于37份苏格兰环境样本，鉴定出13个伪菱形藻物种，包括P. hasleana、P. plurisecta、P. granii和P. dolorosa这四个此前在苏格兰水域未报道过的物种。统计分析表明，仅凭属水平细胞计数（>50,000 cells L-1）预测贝类毒性，与实际情况的一致性很差（Cohen’s kappa = 0.05）。而利用本方法测得的有毒物种相对丰度（将P. australis、P. seriata、P. plurisecta和P. multiseries的读长占比>80% 设为阈值）作为预测指标，与贝类DA含量（>1 mg kg-1）具有中等程度的一致性（kappa = 0.69），且灵敏度高达94%。这证明，有毒物种的相对丰度是比传统属水平细胞计数更好的毒性事件预测指标。
3.4. 新西兰环境研究
对10份新西兰样本的分析鉴定出惊人的17个伪菱形藻物种（包括亚型），凸显了该地区极高的物种多样性。该结果与之前一项广泛的新西兰调查相互印证，证明了本方法在复杂群落中检测低丰度物种的有效性。
3.5. RPA横向流动筛查
作为补充，研究还将RPA assay与核酸内切酶(NFO)结合，开发了针对苏格兰地区主要产毒种P. australis和P. seriata的横向流动试纸条检测法(RPA-LFT)。该方法能够快速（约30分钟）对这些特定有毒物种进行现场筛查，为常规监测提供了一个有用的初筛工具。
结论与讨论部分对该研究的价值和意义进行了总结与展望。本研究成功开发并验证了一种结合RPA与纳米孔测序的强大方法，能够对环境中复杂的伪菱形藻群落进行快速、准确、高分辨率的物种鉴定。该方法不仅灵敏度满足监测需求，还能鉴定出传统方法难以发现的低丰度物种。两个环境案例研究揭示了苏格兰和新西兰水域伪菱形藻群落前所未有的物种多样性，并发现了新的地区分布记录。更重要的是，通过对比苏格兰的互补毒性数据，研究首次在实证层面明确指出，基于分子手段获得的有毒物种相对丰度信息，在预测贝类中DA积累风险方面，远优于目前常规监测所依赖的属水平细胞计数。这一发现对革新有害藻华监测策略具有重要指导意义：它表明，未来监测应朝着物种特异性、甚至毒性潜能定量的方向发展。虽然纳米孔测序数据的准确性仍需通过生成一致性序列等生物信息学步骤进行确认，但其提供的实时物种组成信息已具有巨大的预警价值。此外，本研究展示的RPA-LFT筛查工具，为特定高危区域提供了极快的现场检测方案。随着RPA原始专利的到期和更多供应商的进入，该技术的成本和可及性有望进一步改善。综上所述，这项研究为解决有害藻华监测中的物种鉴定瓶颈提供了强有力的技术方案，不仅提升了我们对伪菱形藻生态分布的认识，也为建立更精准、更高效的海洋生物毒素风险预警体系奠定了坚实的方法学基础。
