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DNA逻辑门多ASO纳米激活器通过TK1 mRNA和miR-122双标志物实现精准肿瘤细胞识别与多重基因沉默治疗，体外抑制率达95%，体内显著抑制HepG-2肿瘤生长且无正常组织毒性。
梁慧萍|范明珠|史明|黄梦娇|舒海燕|何一芳|王世龙|赵树林|徐家瑶|黄勇
中国广西师范大学化学与药学学院药物资源化学与分子工程国家重点实验室，桂林，541004
摘要
能够沉默目标mRNA的反义寡核苷酸（ASOs）在多种疾病的分子治疗中具有很高的吸引力，但其实际应用仍受到脱靶效应和低效率的阻碍。在这里，我们报道了一种DNA逻辑门控的多ASO纳米激活剂（ASONA），它可以在体外和体内实现准确的细胞亚型识别和细胞亚型特异性的分子治疗。ASONA是通过将带有切口的双链DNA和三种三向连接DNA探针与失活的ASO药物组装在金纳米粒子上构建的。作为范例，选择了肝癌HepG-2细胞中的肿瘤相关胸苷激酶1（TK1）mRNA和microRNA-122（miR-122）作为“与”门输入。ASONA对这些输入作出响应，引发级联链置换反应，产生显著放大的荧光，并持续激活三种类型的ASO药物。该ASONA能够区分HepG-2肿瘤细胞与正常细胞及其他类型的肿瘤细胞，并且仅在HepG-2肿瘤细胞中对多个目标癌基因实现高沉默效率。更重要的是，它能够在体内区分HepG-2肿瘤亚型与其他肿瘤，并且对正常组织没有副作用。总体而言，这种ASONA为准确识别特定细胞亚型和在体外及体内精确激活特定细胞亚型中的多种ASO提供了一种通用方法，可以扩大ASO在精准诊疗中的应用范围。
引言
反义寡核苷酸（ASOs）能够沉默与疾病相关的基因，已成为治疗多种人类疾病（包括癌症）的有前景的治疗手段[1]、[2]、[3]。然而，尽管经过数十年的努力，至今仍没有基于ASO的抗癌疗法获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准[4]。ASO治疗成功临床应用的关键挑战之一是将其高效且安全地递送到体内目标细胞中，这主要是由于它们的细胞渗透性差、易降解、快速清除以及脱靶效应[5]、[6]。为了递送ASO药物，已经开发了多种载体，如聚合物[7]、[8]、脂质体[9]、[10]、[11]、核酸纳米结构[12]、[13]、[14]以及无机纳米颗粒[15]、[16]、[17]。这些合理设计的递送系统不仅能够增强细胞对ASO的摄取，还能保护它们免受酶的降解。然而，裸露ASO的不可避免泄漏以及这些递送系统中的脱靶毒性降低了分子治疗的特异性和效率。作为一种替代方法，通过特定的内源性刺激在目标细胞中可控地原位激活ASO可以提高治疗的特异性和效率，从而为癌症分子治疗提供了有希望的策略。近年来，已经构建了一些可控的原位ASO激活系统，用于激活型分子治疗[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。在肿瘤相关生物标志物（如酶、谷胱甘肽（GSH）和microRNAs）的刺激下，这些系统被激活，从而以较低的副作用杀死肿瘤细胞[20]、[21]、[22]、[23]。然而，大多数这些ASO激活系统仅对单一生物标志物作出响应。由于大多数生物标志物通常被多种类型的细胞共享，或者肿瘤细胞中过表达的生物标志物在正常细胞中也以低水平表达，这种单一锁定设计不可避免地导致ASO在肿瘤外的激活，从而降低了癌症治疗的特异性。此外，现有的ASO激活系统仅适用于单个基因的沉默。考虑到癌症的进展受多种遗传途径调控[26]，仅通过沉默一个基因的治疗效果是有限的。为了进一步提高癌症治疗的精准性和有效性，迫切需要开发一种能够通过多种生物标志物的共存来激活的多ASO原位激活策略，以增强治疗的特异性和效率。
由于DNA分子具有高可编程性和沃森-克里克碱基配对的预测性，以及它们能够以高亲和力和特异性结合广泛的目标，因此成为构建分子逻辑门[27]、[28]、[29]、纳米机器[30]和纳米设备[31]的优秀构建块。其中，DNA逻辑门可以响应特定的外部输入（例如小分子、核酸和蛋白质），然后执行复杂的信息处理和精确的控制任务。DNA逻辑门的这些惊人能力激发了它们在多个领域的应用探索，如计算信息处理[32]、[33]、生物传感和成像[34]、[35]、[36]、[37]、控制药物释放[38]以及疾病诊断和治疗[39]、[40]。特别是基于DNA的与逻辑门，只有在所有输入（两个或更多逻辑输入）同时存在时才产生输出，因此在癌症的准确诊断和治疗方面引起了越来越多的关注[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。例如，一种带有多个适配体和抗癌药物的DNA逻辑门控纳米机器人被开发用于利用多种肿瘤细胞表面蛋白标志物作为输入进行肿瘤的多重诊断和协同治疗[46]。一种使用肿瘤细胞膜上过表达的受体和细胞内microRNA-21作为输入的与逻辑DNA纳米机器被构建，用于通过跨越癌细胞膜的计算实现精确的光动力治疗[47]。最近，还设计了一种用于利用三种microRNA作为输入的精确成像引导的光动力/热疗肿瘤的与逻辑纳米设备[48]。尽管取得了令人鼓舞的进展，但能够同时进行细胞亚型识别和在特定细胞亚型中原位激活多种ASO的DNA逻辑门平台，以实现体内特定肿瘤的准确诊断和联合分子治疗，仍然缺乏。
在这里，我们设计了一种DNA逻辑门控的多ASO纳米激活剂（ASONA），在两种生物标志物——肿瘤相关胸苷激酶1（TK1）mRNA和microRNA-122（miR-122）的共同刺激下，同时激活肿瘤成像和分子治疗，以提高诊疗的特异性和效率。在我们的设计中，ASONA的所有组件（包括带有切口的双链DNA和三种用Cy5标记的三向连接（TWJ）DNA探针以及失活的ASO药物）都集成在单个金纳米颗粒（AuNP）上，这使得ASONA能够将所有组件整体递送到目标位置，而无需额外的转染试剂。一旦内化到目标细胞中，TK1 mRNA和miR-122就作为“与”门输入，通过引发级联链置换反应（CTSDR）来操作ASONA，从而产生高度放大的荧光信号，并分别持续激活三种ASO药物，用于原位成像和联合分子治疗。这种DNA逻辑门控的ASONA不仅可以区分HepG-2肿瘤细胞与正常细胞及其他类型的肿瘤细胞，还能在体内区分HepG-2肿瘤亚型与其他肿瘤。更重要的是，与传统基于ASO的基因干扰技术[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]相比，由TK1 mRNA/miR-122双重触发的ASONA原位细胞内多ASO激活能够提供更高的治疗特异性和效率，同时消除了脱靶毒性。ASONA的高集成度、灵活的可控性以及优越的特异性还可以进一步扩展到活体系统中其他核酸和生物分子的检测和成像，以及其他基因药物的原位激活。
ASONA的制备
将巯基化链R和链H以1:2的比例混合在磷酸盐缓冲盐水（PBS：100 mM NaCl、15 mM磷酸盐、5 mM KCl，pH 7.4）中。同样，巯基化链C1与链T1和链ASO1以1:1:2的比例混合在PBS溶液中。巯基化链C2与链T2和链ASO2以1:1:2的比例混合在PBS溶液中。最后，巯基化链C3与链T3和链ASO3以1:1:2的比例混合在PBS溶液中。将混合物加热至90°C。
为了构建DNA逻辑门控ASONA，设计了一种带有切口的双链DNA（H/R）和三种用Cy5标记的三向连接（TWJ）DNA探针（TWJ-1、TWJ-2和TWJ-3）。H/R杂化物是通过触发DNA与链R的杂交形成的。TWJ-1探针是通过链C1与链T1和Cy5标记的链ASO1的杂交形成的，而TWJ-2和TWJ-3探针则是通过链C2与链T2和Cy5标记的链ASO2的杂交以及链C3与...
总结来说，我们成功构建了一种DNA逻辑门控ASONA，它能够在体内对TK1 mRNA和miR-122作出响应，作为智能诊疗纳米平台，用于特定肿瘤的准确成像和精确的联合分子治疗。这种ASONA的所有组件都高度集成在单个AuNP上，使其能够将所有组件整体递送到目标位置，而无需额外的转染试剂。此外，与...
梁慧萍：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。
范明珠：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。
史明：研究、正式分析。
黄梦娇：方法学、正式分析。
舒海燕：方法学、正式分析。
何一芳：方法学、正式分析。
王世龙：方法学、正式分析。
赵树林：方法学、正式分析。
徐家瑶：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿。
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
本工作得到了国家自然科学基金（22264006）、广西自然科学基金（2024GXNSFBA010251和2019GXNSFFA245006）、BAGUI学者计划以及BaGui青年顶尖人才计划的财政支持。
