编辑推荐：
周围神经损伤（PNI）治疗疗效有限，铁死亡与PNI发生发展密切相关但机制不明确。本研究通过体内外实验发现，葛根素（Pu）可促进PNI后神经再生，其机制为抑制ACSL4依赖的铁死亡。分子对接和动态模拟显示Pu竞争性结合ACSL4的亚麻酸（AA）结合位点，特别是Leu468和Thr469残基，CETSA和MST实验验证了这一结合，基因敲除进一步证明ACSL4的关键作用。研究证实Pu通过调控ACSL4抑制铁死亡，促进神经形态和功能恢复，为铁死亡相关疾病治疗提供新策略。
孙涛|黄立新|赵一博|孙秦|罗曦|吴志敏|孙军|李明阳|霍青义|王慧
中山大学第三附属医院神经外科，中国广东省广州市天河区天河路600号，510630
摘要
周围神经损伤（PNI）是一种常见疾病，治疗效果较差。研究表明铁死亡（ferroptosis）与PNI的发生和发展密切相关，但需要进一步深入研究。葛根中的抗氧化剂葛根素（Puerarin，简称Pu）可能有助于缓解PNI，但其作用机制尚不明确。本研究通过体内和体外实验探讨了Pu在PNI中的作用。我们发现Pu可以促进PNI后的神经再生，随后通过经典的氧-葡萄糖剥夺（OGD）细胞损伤模型来探索其潜在机制。RNA测序显示Pu通过ACSL4依赖的铁死亡途径减轻OGD引起的损伤；分子对接实验表明Pu能与花生四烯酸（AA）的ACSL4活性位点竞争结合；动力学模拟显示Leu468和Thr469是Pu与ACSL4结合的主要位点，这一结论通过细胞热位移分析（CETSA）、微尺度热泳（MST）和Pull-down实验得到验证。体内和体外实验均表明，Pu通过抑制ACSL4依赖的铁死亡作用改善了神经的形态、功能和电生理特性。功能丧失实验进一步证实了ACSL4在Pu的神经保护作用中的关键作用。总之，本研究表明Pu通过ACSL4依赖的铁死亡途径促进PNI恢复，为铁死亡相关疾病的治疗提供了新的策略。
引言
周围神经损伤（PNI）是一种常见且严重的疾病，会严重影响特定神经分布区域的感觉、运动和自主功能[1]。其原因通常包括创伤、化学物质暴露、内分泌紊乱或医源性因素。尽管周围神经系统在损伤后的再生潜力大于中枢神经系统，但PNI仍会导致不同程度的功能障碍，严重影响患者的生活质量，并给医疗系统带来沉重负担[1]。因此，大量研究致力于探索PNI的微环境和组织病理学，以促进神经再生并改善预后[2][3]。铁死亡是一种依赖铁离子并由脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式，自2012年提出以来受到越来越多的关注[5]。该过程涉及细胞内铁离子的异常积累，导致氧化应激加剧和随后的脂质过氧化，进而破坏细胞膜结构和功能，最终导致细胞死亡[5]。铁死亡与多种疾病的发生、发展和预后密切相关，如恶性肿瘤[6]、炎症[7][8]和自身免疫性疾病[9]。研究表明，铁死亡在PNI的发生、发展和结果中起着关键作用[3][4]。ACSL4是一种关键的脂肪酸代谢酶，可催化长链脂肪酸（如花生四烯酸）与辅酶A的结合，生成活化的酰基-CoA衍生物。在神经元缺血-再灌注损伤后，ACSL4是铁死亡的关键调节因子[10]，其激活会抑制神经再生[11]。我们之前的研究也表明，ACSL4的激活会加重PNI后的铁死亡，阻碍神经再生[12]。因此，针对ACSL4来调节PNI后的铁死亡过程可能对PNI的治疗具有重要意义。
葛根素（Pu）是从葛根中提取的活性成分，具有多种药理作用，如对心血管疾病[13]、炎症[14]和骨质疏松症[15]的改善作用。然而，Pu在PNI中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨Pu在PNI中的作用及其潜在机制。首先，我们研究了Pu对PNI的体内效应，并通过RNA测序阐明了其治疗机制和潜在靶点。进一步通过分子对接、分子动力学模拟、细胞热位移分析（CETSA）和靶点敲低实验验证了这些结果。总之，本研究表明Pu在促进PNI后神经再生方面具有治疗效果，为其治疗铁死亡相关疾病提供了潜在前景。
材料
RSC96细胞购自武汉普罗莱夫生物科技有限公司（CL-0199，中国武汉）；Pu（B20446，中国云南）购自云南技术公司。GAPDH单克隆抗体（60004–1-Ig）、ACSL4多克隆抗体（22401–1-AP）、GPX4单克隆抗体（67763–1-Ig）、SLC7A11多克隆抗体（26864–1-AP）、S100B多克隆抗体（CL488–15146）和NF200多克隆抗体（18934–1-AP）购自Proteintech公司。
葛根素促进PNI后的神经再生和功能恢复
葛根素是一种从葛根中分离出的单体化合物（图1A），已在多种病理生理疾病中得到应用，如组织修复[24]和炎症反应[26][27]。此外，它在中枢神经系统中也显示出良好的治疗潜力[28]，但其对周围神经系统的影响仍需进一步研究。为了探讨Pu对PNI的药理作用，我们建立了坐骨神经压迫引起的大鼠PNI模型，每组包含5只大鼠。
讨论
PNI具有高发病率、治疗效果不佳以及频繁出现的严重肢体功能障碍，给全球医疗和社会经济带来巨大负担。传统上，神经修复主要依赖外科技术，如端对端吻合、端侧吻合和神经移植[32][33]。虽然外科干预可以快速修复受损神经的解剖结构，但功能恢复——这一最关键且最具挑战性的方面——往往难以实现。
结论
本研究发现，Pu通过抑制ACSL4依赖的铁死亡途径促进PNI后的髓鞘再生和神经再生。鉴于其强大的抗铁死亡能力和优异的生物相容性，Pu成为治疗PNI及其他铁死亡相关疾病的潜在候选药物。这一发现有望推动抗铁死亡药物的研发，并推动其在生物医学治疗和研究中的应用。
缩写
- PNI
- 周围神经损伤
- OGD
- 氧-葡萄糖剥夺
- qRT-PCR
- 定量实时聚合酶链反应
- CETSA
- 细胞热位移分析
- MST
- 微尺度热泳
- OCR
- 氧消耗率
- SFI
- 坐骨神经功能指数
- ΔΨm线粒体膜电位
- EPT伸展姿势推力
- TEM透射电子显微镜
- LFB卢索尔快蓝（luxol fast blue）
- AA花生四烯酸
- RMSD均方根偏差
- rAAV重组腺相关病毒
- PUFA
- 多不饱和脂肪酸
| IF | - 免疫荧光
| PEs |
CRediT作者贡献声明
孙涛：撰写——审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计、实验实施、概念构建。黄立新：软件应用、方法学设计、实验实施。赵一博：软件应用、方法学设计。孙秦：撰写——审稿与编辑、方法学设计、数据分析。罗曦：软件应用、方法学设计。吴志敏：软件应用、方法学设计。孙军：软件应用、方法学设计。李明阳：方法学设计。霍青义：方法学设计。王慧：结果验证、项目监督、资金申请。
资助
本研究得到了中山大学临床研究5010计划（编号2021001）、中山大学第三附属医院“五五”项目（编号2023WW504）、广州市科技项目（编号202201020578）以及广东省基础与应用基础研究基金（编号2022A1515012433和2024A1515012906）的支持。
