亮化蛋白：具有化学开关的荧光探针，用于蛋白质标记技术

《JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY C-PHOTOCHEMISTRY REVIEWS》：Brightening Proteins: Fluorogenic Probes with a Chemical Switch for Protein Tag Labeling Technology

荧光蛋白成像技术的局限性及自标签探针的荧光调控机制研究。摘要：蛋白质动态成像对疾病研究至关重要，但传统荧光蛋白存在光漂白、近红外发射器不足等问题。本文综述了共价与非共价自标签技术，如SNAP标签、HaloTag等，及其配套荧光探针的调控机制（FRET、淬灭剂、分子旋转、吸收位移等），分析了优缺点并展望未来方向。分隔符：

　　

堀 幸一郎

九州大学理学研究科化学系，日本福冈市西区本冈744

摘要

蛋白质通过严格调控的表达、定位和相互作用来维持细胞稳态。其失调是导致从癌症到神经退行性疾病等多种疾病的原因。因此，对这些动态在活体系统中的成像不仅有助于理解生物现象，也有助于阐明病理机制。尽管基因编码的荧光蛋白（FPs）可以实现活细胞成像，但它们存在一些局限性，包括易受光漂白的影响、近红外（NIR）发光剂稀缺、脉冲追迹控制能力有限以及标签体积较大。为了克服这些限制，人们开发了结合蛋白质标签和特定荧光探针的蛋白质标记技术。这些技术具有更好的光稳定性、近红外（NIR）兼容性、按需的时间标记能力以及更小的标签尺寸。本综述总结了用于共价和非共价自标记标签的荧光探针的最新进展，重点介绍了抑制游离探针背景信号并促进蛋白质标记后发射的荧光调控机制。同时讨论了探针设计策略的优点和局限性，并展望了蛋白质标记技术的发展方向。

引言

生物大分子，包括蛋白质和核酸，在维持、传递和调节细胞生理功能方面发挥着不可或缺的作用。蛋白质通过响应外部信号（如激素和细胞因子）以及环境因素（包括温度变化和氧化应激）而动态改变表达水平和亚细胞定位来调节细胞功能。显然，要正确控制细胞功能和稳态，蛋白质需要在与时间、数量和位置都适宜的情况下表达。这些特性的紊乱可能引发包括癌症和神经退行性疾病在内的多种疾病。除了蛋白质表达水平和定位外，涉及蛋白质自组装、与其他蛋白质和非蛋白质生物分子的相互作用以及伴随的相分离等现象现在也被认为是生物功能的核心调节因素，并已成为当代生命科学研究的主要课题。因此，用于成像和阐明蛋白质动态的技术已在生命科学、医学和药物发现领域得到广泛应用。

免疫染色长期以来一直用于评估细胞蛋白质的表达和定位。然而，免疫染色的一个根本局限性在于细胞固定会破坏大量关于蛋白质的动态信息。为了获得活细胞中目标蛋白质的实时图像，人们开发了基于荧光蛋白的技术。荧光蛋白最初是在维多利亚水母（Aequorea victoria）中发现的，它们在翻译后会产生荧光团并具有内在荧光性[1]、[2]、[3]。将荧光蛋白基因与目标蛋白（POI）基因融合，并在活细胞中表达该融合蛋白，可以通过荧光信号识别POI的定位和时间行为[4]、[5]。然而，基于荧光蛋白的方法存在一些局限性：许多变体容易漂白且光稳定性有限，近红外（NIR）区域中可用于体内成像的明亮发光剂很少，需要精确时间控制的脉冲追迹实验难以用现有仪器完成，而且标签相对较大（约27 kDa）。为了解决这些问题，化学家们开发了结合合成荧光探针和蛋白质标签的蛋白质标记技术[6]、[7]、[8]。

在这种方法中，标签与目标蛋白（POI）融合，并用合成荧光探针标记，以便在活细胞中成像标记的POI（图1）。探针由合成荧光团和特异性结合标签的配体组成。这项技术的一个优点是可以使用比荧光蛋白更亮、光稳定性更高的合成荧光团，包括近红外（NIR）发光剂，从而实现体内成像。此外，由于探针可以在特定时间点添加到细胞中，因此可以按需标记蛋白质。这便于进行脉冲追迹实验，并能够以高时空分辨率追踪蛋白质动态。此外，还报道了许多标签，其中一些标签的体积比荧光蛋白更小。

1998年，Tsien及其同事的开创性研究使用双砷荧光染料FlAsH1和ReAsH2作为标记探针，结合带有四半胱氨酸基序的肽标签，成功地在活细胞中成像了蛋白质的定位[6]、[9]。21世纪初，进一步对双砷探针进行了衍生和改进，使用了Nile Red（BArNile-EDT23）、Cy3（AsCy34）和氟化荧光素（F2FlAsH5）作为骨架[10]、[11]、[12]。然而，使用有毒的砷以及添加探针后需要硫醇洗涤成为了瓶颈。2003年，Johnsson及其同事开发了一种名为SNAP-tag的20 kDa蛋白质标签，该标签源自突变的O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。他们还开发了基于O⁶-苯基鸟嘌呤（BG）衍生物的探针作为特异性配体[7]、[13]，并报告称这些探针没有表现出细胞毒性[7]。他们还创建了CLIP标签，该标签可以用胞嘧啶衍生物配体标记，从而实现与SNAP标签的生物正交多重蛋白质标记[14]。Promega推出了HaloTag，这是一种34 kDa的卤代烷脱氢酶突变体，其催化作用在底物捕获后停止，确保底物保持共价结合[15]、[16]、[17]。HaloTag的一个关键优点是其配体结构简单（卤代烷），便于通过将染料与配体偶联来合成荧光标记探针。尽管结构简单，HaloTag仍表现出高反应性和特异性，使其被许多研究人员广泛使用。由于HaloTag相对较大，人们也探索了更小的标签。例如，有一种来自紫色硫细菌的14 kDa光活性黄色蛋白质标签（PYP-tag），可以通过其配体进行标记[18]。这些及相关系统通常在探针和标签之间形成共价键。其他共价系统还包括BL-tag[19]、dC10α-tag[20]、Cutinase-tag[21]、CRABPII-tag[22]和Retroaldolase-tag[23]。除了这些共价系统外，还开发了非共价标记标签，包括eDHFR/TMP-tag[24]、FAST[25]、工程化的FKBP12[26]和FAP[27]，同时也报道了共价eDHFR/TMP-tag变体[28]和非共价HaloTag配体[29]。由于这些共价和非共价系统无需额外酶即可进行标记，因此这些蛋白质标签被称为自标记标签。相反，也有报道了借助酶辅助的蛋白质标记技术，例如sortase A[30]、transglutaminase[31]、phosphopantetheinyl transferase[32]、[33]、biotin ligase[34]、lipoic acid ligase[35]和formylglycine生成酶[37]。

尽管标签和合成探针种类繁多，但仍存在一个重要问题：当探针无法与蛋白质标签结合或添加过量时，它们可能以未结合的游离状态存在于细胞中。当这些游离探针无法通过洗涤去除，或者希望在不洗涤的情况下快速成像蛋白质动态时，游离的荧光探针会产生背景信号。为了解决这个问题，人们开发了在游离状态下呈暗色或微弱的荧光探针，但在蛋白质标记后会增强荧光强度。人们利用各种化学原理将荧光开关整合到蛋白质标签探针中，设计并合成了许多此类荧光探针。

基于F?rster共振能量转移（FRET）的荧光探针

FRET是一个与距离相关的过程，其中两个发色团之间发生共振能量转移[38]、[39]、[40]。它需要一个荧光供体和一个吸收光谱与供体发射光谱重叠的附近受体。如果受体具有荧光性，供体激发会导致受体发射荧光；相反，非荧光受体的存在会导致供体荧光淬灭[41]。因此，用于蛋白质标签标记的荧光探针

使用基于邻近效应机制的荧光淬灭剂的荧光探针

为了克服基于FRET策略的局限性，人们开发了使用较小或疏水性较低的淬灭剂的荧光探针，这些淬灭剂通过接触淬灭或光诱导电子转移（PeT）发挥作用（图5）[18]、[20]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]、[63]、[66]。在接触淬灭（也称为静态淬灭）中，染料与淬灭剂形成非荧光基态复合物[51]。而在PeT中，荧光通过电子转移被抑制

具有环境敏感性感应功能的荧光蛋白标记探针

基于淬灭剂的设计适用于许多染料。然而，它们通常需要组装多个组件（淬灭剂、染料和标签配体），这带来了合成上的限制，并增加了分子体积，可能会降低膜通透性。此外，设计同时满足水溶性、膜通透性和防止在细胞器中错误定位或积累的探针仍然具有挑战性

通过分子旋转控制荧光发射

虽然TICT型分子转子会导致分子扭曲从而抑制荧光，但也有报道指出，某些分子转子的荧光抑制机制并非基于TICT，而是基于分子动态性质引起的非辐射衰减[82]。这类非TICT型分子转子也被用于荧光蛋白质标记。含有meso-phenyl基团的BODIPY染料是众所周知的分子转子[83]。在低粘度环境中

表现出吸收位移的荧光配体

2010年代中期，人们将基于吸收位移和环境敏感性的组合机制应用于非共价蛋白质标记系统。在该系统中，使用荧光蛋白发色团类似物4-羟基苯基乙烯基罗丹宁（HBR27）衍生物作为配体（图9A、B）[90]、[91]、[92]、[93]、[94]。这些蛋白质标签被称为荧光激活和吸收位移标签（FAST），是通过定向进化技术生成的[90]。一个组合文库

调节螺环化平衡的荧光探针

如前所述，xanthene染料及其类似物常用于荧光探针应用，因为许多这类染料具有高摩尔吸光度和量子产率，能产生强烈的成像信号。特别是罗丹明及其类似物因其出色的亮度和光稳定性而受到关注。因此，人们投入了大量努力开发无需淬灭剂的荧光探针，这些探针在蛋白质标记后能够被激活

结论与展望

现在已经开发出了基于多种荧光调控机制的广泛荧光蛋白质标记探针。基于FRET的设计原则上与几乎所有荧光团兼容，因为许多非发光受体覆盖了可见光谱。然而，这些探针可能会增加合成复杂性、体积和疏水性，并对细胞膜通透性造成挑战。接触淬灭和PeT机制可以解决其中一些问题，但需要谨慎使用

在撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本稿时，作者使用了ChatGPT5和DeepL来编辑英文部分。使用这些工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究部分得到了JSPS KAKENHI（资助编号：JP24K01647、JP 25K22312和JP25H02281）、Astellas代谢疾病研究基金会以及Opt-Science and Technology研究基金会的支持。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

堀 幸一郎于2004年在日本京都大学获得药学博士学位。2004年至2006年，他在美国洛克菲勒大学担任博士后研究员。2006年，他被任命为大阪大学助理教授，并于2016年晋升为副教授。2022年，他转到九州大学任职，目前担任教授。他的研究兴趣是开发用于成像的荧光探针