通过将醋酸丁酸梭菌（Clostridium acetobutylicum）与隆达氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）进行共培养，实现了从碳负值葡萄糖发酵过程中获得超理论产量的异丙醇

合成微生物共培养通过高密度发酵显著提升异丙醇生产效率，克服热力学限制实现超理论产率。研究采用工程化醋酸棒状菌（缺乏丁酸/丁醇合成能力）与久保棒状菌的共培养系统，通过伪连续发酵模式在3.6L生物反应器中验证了连续碳负向异丙醇生产。共培养中氢代谢耦合及高密度条件下的协同效应突破单菌代谢瓶颈，异丙醇产率达0.286 mol/gcdw，实现葡萄糖碳源利用率91.3%。

　　

Noah B. Willis | Jonathan K. Otten | Hyeongmin Seo | Pradeep C. Munasinghe | John D. Hill | Eleftherios T. Papoutsakis

美国特拉华大学化学与生物分子工程系，纽瓦克，DE州

摘要

合成微生物共培养系统通过将多种微生物的设计功能整合到一个过程中，为可持续生产燃料和化学品提供了巨大潜力。大多数关于定义明确的共培养研究都是在批次培养条件下进行的，这些条件下的细胞密度相对较低，而实现工业上具有实际意义的体积生产力通常需要高细胞密度的补料批次或连续培养过程以及细胞保留机制。在本研究中，我们探讨了增加细胞密度对异丙醇产量的影响。所使用的共培养体系由Clostridium ljungdahlii与经过基因改造的Clostridium acetobutylicum（CACas9 Δhbd-p95ace02_atoB）组成，后者缺乏4-碳代谢途径，但在质粒上过度表达了丙酮生成途径。CACas9 Δhbd-p95ace02_atoB能够生成丙酮而不产生4-碳代谢产物，而C. ljungdahlii则将丙酮转化为异丙醇。为了探索该共培养系统实现超理论异丙醇产量的潜力，我们发现CACas9 Δhbd-p95ace02_atoB中的NADH驱动的氢气转化过程是单培养条件下丙酮生成的热力学限制步骤，因此也是共培养过程中异丙醇生成的限制因素。随后我们证明了C. ljungdahlii能够通过消除共培养中的氢气积累来缓解这一问题。伪灌流共培养实验表明，高细胞密度以及较高的C. ljungdahlii种群比例可以显著提高异丙醇产量，超越了CACas9 Δhbd-p95ace02_atoB单培养的热力学限制。最后，我们在一个3.6升规模的灌流生物反应器中展示了葡萄糖连续发酵生成异丙醇的过程，且异丙醇是唯一的产物。

引言

涉及Clostridium属微生物的合成共培养系统因能够克服传统生物工艺的局限性而越来越受到重视，成为可持续生产燃料和化学品的有力工具（Charubin等人，2018年）。工业规模的微生物生产过程通常依赖于经过充分研究的模式生物（常带有显著的基因改造）或未经定义的野生型（WT）微生物群落（例如在废水处理和食品制造中）。相比之下，利用补料批次或灌流生长模式的共培养研究较少，而这些模式通常需要达到高细胞密度以及相应的体积生产力，以实现经济上的可行性。

由于微生物共培养本质上依赖于优化的种间相互作用，并且随着细胞密度的增加，种间细胞距离平均会减小，因此可以合理推测，在高细胞密度下，特定微生物群落或共培养系统的表现可能与低细胞密度时大不相同，这使得培养细胞密度和相对物种丰度成为关键的操作参数。例如，生物膜的形成——一种普遍存在的古老方法，已被证明对自然和传染性微生物群落的形成、功能及韧性具有显著影响（Hall-Stoodley等人，2004年）。近年来越来越多的证据表明，在某些情况下，合成共培养可以通过纳米管状结构或种间细胞接触实现细胞质物质的直接交换（Hill和Papoutsakis，2025年综述）。我们的研究团队已广泛证明，在Clostridium acetobutylicum和Clostridium ljungdahlii的共培养中，种间接触能够促进蛋白质、RNA和DNA的大规模交换，并生成种间杂交细胞（Charubin等人，2024年；Charubin等人，2020a年；Charubin和Papoutsakis，2019年）。然而，不同绝对和相对细胞密度对C. acetobutylicum-C. ljungdahlii共培养的独特行为以及其他微生物共培养中的许多有趣现象的影响仍大多未被探索。可以认为，绝对细胞密度和相对物种丰度是优化这些种间互作的重要调节参数。 除了细胞物质的种间交换和细胞融合外，C. acetobutylicum-C. ljungdahlii共培养还具有其他实际应用价值的特点。具体而言，这种共培养系统相对于单培养而言，提高了碳的回收率和每摩尔消耗葡萄糖的酒精产量（Charubin和Papoutsakis，2019年）。C. acetobutylicum-C. ljungdahlii组合还能合成大量异丙醇，这是两种微生物单独培养都无法产生的有价值化学品。C. acetobutylicum生成丙酮，而C. ljungdahlii将其转化为异丙醇。值得注意的是，如果将这两种微生物分开并置于可渗透膜之间，会显著影响异丙醇的形成以及葡萄糖向代谢产物的转化效率（Charubin和Papoutsakis，2019年）。这些发现表明，种间接近性和细胞间接触对于异丙醇的生产以及其他有用表型的形成至关重要。通过优化物种比例并在高密度反应器系统中培养这些微生物群落，可以进一步增强C. acetobutylicum和C. ljungdahlii之间的互作，从而可能进一步提高底物碳向代谢产物的转化效率，尤其是异丙醇的产量。 在这项研究中，为了提高丙酮产量（进而提高共培养中的异丙醇产量），我们使用了先前经过工程改造的C. acetobutylicum菌株CACas9 Δhbd（Seo等人，2024年），该菌株经过染色体编辑去除了4-碳代谢产物（丁酸和丁醇）的生成能力。进一步通过引入含有合成丙酮生成途径的质粒对该菌株进行了改造。我们使用该菌株进行单培养并与C. ljungdahlii共培养，研究了高密度共培养和物种比例对异丙醇产量的影响。首先，我们发现了影响异丙醇产量的热力学限制因素，即在没有工程设计的电子受体情况下，C. acetobutylicum单培养无法仅生成丙酮。接下来，我们提出利用产乙酸菌（如C. ljungdahlii）的电子转移能力来克服这一限制。随后证明，高密度的“伪灌流”共培养，特别是C. ljungdahlii种群比例较高的共培养，能够进一步提高异丙醇产量，超越C. acetobutylicum单培养的最大生物产量。最后，我们在灌流生物反应器中证明了这种超理论产量的稳定性，实现了葡萄糖连续发酵生成异丙醇的过程，且异丙醇是唯一的产物，同时表现出较高的体积生产力。

章节摘录

C. acetobutylicum的培养

对于CACas9 Δhbd-p95ace02_atoB菌株，将其冻存菌液划线接种到添加了30 mM丁酸钠和40 μg/ml克拉霉素的2xYTG琼脂平板上，并在37°C的厌氧培养箱中培养3天，以促进菌落生长和孢子形成。后续的所有培养步骤均在添加了30 mM丁酸钠（“Turbo CGMB”）和100 μg/ml克拉霉素的液体Turbo CGM培养基中进行（Charubin和Papoutsakis，2019年）。

C. acetobutylicum中4-碳代谢途径基因的过表达会使得碳从丁醇重新定向到乙醇，而非丙酮

正如最近的研究报道（Seo等人，2024年），我们的实验室已经通过CRISPR技术成功敲除了C. acetobutylicum的hbd基因，从而阻断了其4-碳代谢途径（图1A）。这种C. acetobutylicum菌株（“CACas9 Δhbd”）的强劲且持续的生长依赖于少量（通常为30 mM）丁酸的存在（Seo等人，2024年）。

进一步讨论与结论

为了使单一微生物同时利用多种底物并保持目标产品的高产量和生产力，从方法学角度（尤其是对于非模式细菌）以及基本的化学计量和热力学途径限制来看，这极具挑战性。在这里，我们展示了在高密度灌流发酵条件下实施C. acetobutylicum和C. ljungdahlii的共培养策略能够提高丙酮产量。

CRediT作者贡献声明

John D. Hill：数据分析、数据整理。Eleftherios T. Papoutsakis：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。Hyeongmin Seo：数据可视化、验证、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。Pradeep C. Munasinghe：方法设计、实验实施。Noah B. Willis：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、方法设计、实验设计、数据分析。

致谢

本项工作得到了ARPA-E项目（合同编号AR0001505）的支持。N.B.W.和J.D.H.部分获得了美国教育部GAANN奖学金（项目编号P200A210065）的资助。