Zn2+介导的双His6标签串联Z-域组装：一种可保留天然构象与功能的二维蛋白质超分子生物材料新平台

本综述报道了一种利用Zn2+介导（His）6-标签交联构建二维（2D）蛋白质超分子组装体的新策略。核心是利用两端带双（His）6-标签的串联Z-域（（His）6-（Z）2-（His）6），在温和（pH 7，等摩尔Zn2+）条件下自组装形成2D结构。该组装体不仅能保留Z-域天然三级螺旋构象（经圆二色谱证实）及其对免疫球蛋白G（IgG）Fc片段的高特异性结合能力，还为开发新型生物材料（如增强型ELISA检测）提供了通用、易行的模块化平台。

　　

1. 引言

“超分子生物聚合物”是指单体间通过非共价相互作用（如氢键、离子键、范德华力、π-π堆积）可逆组装而成的大分子聚集体。这类材料有望克服传统生物材料无法响应生理信号的局限，在组织修复、药物递送、生物传感等领域具有“下一代”生物材料的潜力。其中，利用螯合剂与金属阳离子间的配位键驱动组装是相对未被充分探索的途径。组氨酸（His）标签因其对Zn²⁺、Ni²⁺等二价阳离子的高亲和力，广泛用于蛋白质纯化。近期研究提示，在蛋白质两端引入（His）₆-标签，可在金属离子存在下诱导其组装。然而，基于完整蛋白质、通过金属-螯合剂复合物可逆交联形成生物材料的途径仍需深入探索。

2. 结果

2.1. 凝胶电泳

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析显示，（His）₆-（Z）₂-（His）₆纯度高于95%。Native-PAGE（非变性凝胶电泳）分析表明，该蛋白在非还原条件下倾向于形成约60 kDa的五聚体，这与之前报道的双（His）₆-标签蛋白的寡聚化倾向一致。

2.2. 远紫外圆二色（CD）光谱

为探究Zn²⁺交联是否会破坏蛋白质二级结构，研究采用了对蛋白质二级结构变化敏感的远紫外CD光谱进行分析。结果表明，在等摩尔Zn²⁺存在下，（His）₆-（Z）₂-（His）₆天然的三螺旋束构象在数小时至数天内均得以保持。这为其在金属交联后仍能保留对IgG的结合亲和力与特异性提供了关键证据。

6-(Z)₂-(His)₆in the absence (black dotted line) or presence of 4.5 μM Zn²⁺(red line) at the indicated time points. Temperature was held constant at 8 °C (281 K).">

2.3. 扫描透射电子显微镜（STEM）成像

STEM成像为（His）₆-（Z）₂-（His）₆单体通过Zn²⁺交联形成二维蛋白质组装体提供了直接证据。将15 μM （His）₆-（Z）₂-（His）₆与等摩尔的Zn²⁺在PBS中于25°C孵育14小时后，观察到了明显的2D蛋白质组装体的形成。这些组装体面积在40–200 nm²之间，且多数相互融合形成覆盖数微米区域的层状结构。高倍镜下可见组装体内部的深色边界线，可能代表较小组装体之间的融合边界或嵌入的蛋白质纤维。而在无Zn²⁺的对照组中，仅观察到独立的盘状结构，证明了金属离子对组装的必要性。同时，有Zn²⁺的样品中也存在少量盘状结构，表明等摩尔金属离子不足以交联全部蛋白质单体。

A–C.Images of 15 μM (His)₆-(Z)₂-(His)₆, incubated with an equimolar concentration of ZnCl₂in PBS at 25 °C (298 K) for 14 h. D.Control: as in A–C,but in the absence of ZnCl₂.">

2.4. 还原条件下结合了hIgG的（His）₆-（Z）₂-（His）₆生物聚合物的凝胶电泳

为验证组装后的（His）₆-（Z）₂-（His）₆2D结构是否保留其结合IgG Fc结构域的能力，研究将多克隆人IgG（hIgG）与预形成的2D组装体共孵育，随后进行短暂离心。SDS-PAGE分析显示，约67%的hIgG和约62%的（His）₆-（Z）₂-（His）₆生物聚合物出现在沉淀中，而非上清液。在缺乏（His）₆-（Z）₂-（His）₆或Zn²⁺的对照实验中，绝大多数hIgG保留在上清液中。这证明了（His）₆-（Z）₂-（His）₆和Zn²⁺离子共同参与了hIgG的特异性捕获与沉淀。进一步使用木瓜蛋白酶消化的hIgG（产生F(ab’)₂和Fc片段）进行实验，证实了结合特异性针对Fc片段。此外，与人类IgA或IgM几乎不结合的结果，也与天然Z-域对IgG Fc的高特异性亲和力一致。

3. 讨论

Zn²⁺诱导的（His）₆-（Z）₂-（His）₆2D蛋白质组装体能够结合并浓缩荧光标记的IgG抗体。荧光显微镜观察显示，在与（His）₆-（Z）₂-（His）₆2D组装体共孵育后，FITC标记的IgG形成强荧光的凝聚物。该过程快速，且依赖于2D组装体的存在。

研究提出了2D组装体形成的可能模型：一个Zn²⁺阳离子与三或四个（His）₆标签配位，通过金属配位键将蛋白质单体连接成二维网络。Zn^{2+对（His）₆标签的高亲和力（K_d= 0.047 μM）使得在低微摩尔浓度（如50 μM）的温和条件下即可实现组装，避免了高浓度自由金属离子可能引起的蛋白质变性。}

该策略展现出广泛的应用潜力。例如，可构建由串联Z-域和酶（如辣根过氧化物酶，HRP）共同组成的2D组装体，用于增强直接酶联免疫吸附测定（ELISA）的检测灵敏度。其中，串联Z-域结合于一抗的Fc段，而组装体上密集的HRP可产生更强的信号。

6)]₂-Z₂domain. The binding of the latter to the Fc-domain of a primary antibody bound to the antigen of interest would direct a large number of HRPs to the antigen, which in turn would produce an intense signal due to the large copy number of HRPs on site. [S], substrate.">

4. 结论

本研究证明，广泛用于亲和层析的（His）₆-标签，当被置于目标蛋白的N端和C端时，也可作为在金属离子调控下进行可控蛋白质组装的有效配体。（His）₆-（Z）₂-（His）₆是继泛素、Cas9和mCherry之后，第四个成功通过此策略构建2D蛋白质组装体的蛋白范例。该方法的通用性、简易性以及对蛋白质天然功能的保留，为在生物技术和医学领域（如生物传感、诊断、组织工程等）设计和制造功能化的合成二维蛋白质材料提供了一个前景广阔的新平台。