《Frontiers in Plant Science》：The alfalfa U-box E3 ligase MsPUB210 interacts with MsICE1 and positively regulates cold tolerance in transgenic Arabidopsis
编辑推荐：
本研究聚焦紫花苜蓿（Medicago sativa L.），首次揭示了其U-box E3泛素连接酶基因MsPUB210在低温胁迫下的重要功能。通过基因调控网络（GRN）预测、AlphaFold2（AF2）结构模拟、酵母双杂交（Y2H）及转基因过表达等综合手段，研究证实MsPUB210能与核心转录因子MsICE1发生物理互作，并通过稳定或调控ICE1蛋白，激活经典的ICE-CBF-COR信号级联反应。实验表明，在拟南芥中异源过表达MsPUB210可显著增强植株的耐冷性，具体表现为活性氧（ROS）积累减少、丙二醛（MDA）含量降低、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性及脯氨酸（Pro）含量升高，同时下游冷响应基因（如AtCBF3、AtCOR47等）表达量显著上调。本工作不仅阐明了MsPUB210在泛素介导的冷信号转导中的关键正调控作用，也为培育耐寒饲草作物提供了宝贵的候选基因靶点。
1 引言
低温胁迫是限制植物生长、发育和生产力的主要非生物胁迫之一。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作为重要的豆科饲草作物，产量潜力高，但对低温胁迫较为敏感。植物进化出了复杂的胁迫响应机制，其中转录后修饰，特别是泛素化（Ubiquitination），在快速调节蛋白稳定性与活性以应对外界环境变化中起着核心作用。泛素-蛋白酶体系统（UPS）由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）顺序催化，而E3连接酶负责识别特定底物，决定了泛素化反应的特异性。U-box型E3泛素连接酶（PUBs）是植物中广泛存在的一类蛋白，其结构稳定，在胁迫响应中扮演多重角色。在紫花苜蓿中，全基因组分析已鉴定出210个PUB基因，但其在冷胁迫响应中的具体功能和分子机制仍不清楚。本研究旨在探究紫花苜蓿U-box E3连接酶基因MsPUB210在低温适应中的作用。
2 材料与方法
2.1 生物信息学分析与蛋白质互作验证
为探索MsPUB210与MsICE1在冷响应基因调控网络（GRN）中的功能关联，研究利用STRING数据库构建了以拟南芥为背景的蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络。输入序列包括MsPUB210、MsICE1以及25个已验证的冷胁迫相关蛋白。同时，基于多个紫花苜蓿品种的RNA-seq数据，计算了MsPUB210与MsICE1表达量之间的皮尔逊相关系数。为从结构上验证互作可能性，利用AlphaFold2（AF2）对MsPUB210-MsICE1及MsPUB210-AtICE1等异源复合物的三维结构进行了预测，并分析了潜在的泛素化位点（赖氨酸，K）。为确保酵母双杂交（Y2H）实验的可靠性，预先进行了转录自激活验证实验。随后，通过Y2H实验直接验证了MsPUB210与MsICE1之间的物理互作。
2.2 基因克隆与转基因植株创制
从冷处理的紫花苜蓿叶片中提取总RNA，逆转录合成cDNA，并通过PCR扩增获得MsPUB210的全长编码序列（CDS），经测序验证后克隆至表达载体。通过农杆菌介导的花序浸染法将pCAMBIA1300-MsPUB210重组载体转化拟南芥，经潮霉素筛选和PCR鉴定，获得纯合的T3代过表达株系（S2， S5， S9），并通过qRT-PCR确认了MsPUB210的高表达。
2.3 生理生化与基因表达分析
将4周龄的野生型（WT）和转基因拟南芥植株在4°C下进行24小时冷处理，评估其表型变化。测定了一系列生理生化指标，包括叶绿素（CHL）含量、脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量以及过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性。此外，通过qRT-PCR技术分析了多个冷响应标记基因的相对表达量，包括AtCBF3、AtCOR15A、AtCOR47、AtCOR6.6、AtERD10、AtRAB18和AtNCED3，以GAPDH作为内参基因。
3 结果
3.1 基因调控网络分析与AF2预测的蛋白复合物
共表达分析显示，MsPUB210与MsICE1的表达呈极显著正相关（R = 0.95, p < 0.001）。PPI网络分析预测MsPUB210与MsICE1存在直接互作关系，且两者均与冷响应通路中的关键节点（如CBF、NCED家族蛋白）相连。AF2预测的MsPUB210-MsICE1和MsPUB210-AtICE1复合物三维模型显示，二者在界面处存在潜在的相互作用氨基酸残基，为物理互作提供了结构依据。转录自激活实验证实MsPUB210蛋白在酵母系统中无自激活活性，适合进行Y2H实验。
3.2 MsPUB210在冷胁迫下与MsICE1互作调控其稳定性
酵母双杂交实验直接证明，携带MsPUB210-BD和MsICE1-AD的酵母细胞能在高严苛选择性培养基（SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His + 5 mM 3-AT）上生长，而对照组合不能，这证实了MsPUB210与MsICE1在体内存在直接的物理相互作用。
3.3 MsPUB210增强转基因拟南芥的冷胁迫耐受性
经冷胁迫处理后，过表达MsPUB210的拟南芥株系（S2, S5, S9）仅出现叶片轻微皱缩，而野生型植株则表现出严重的萎蔫、卷边和不可逆的失水收缩，表明转基因植株具有更强的表型耐受性。生理指标测定显示，与WT相比，转基因株系在冷胁迫下具有更高的叶绿素和脯氨酸含量、更低的MDA积累量，以及显著提升的SOD、POD和CAT活性，说明其氧化损伤更轻，膜系统更稳定，抗氧化能力更强。
3.4 MsPUB210转基因拟南芥中抗性相关基因的表达谱
qRT-PCR结果显示，在冷胁迫下，所有检测的7个冷响应基因在MsPUB210过表达株系中的表达量均显著高于野生型。特别是核心转录因子AtCBF3，以及下游效应基因AtCOR15A、AtCOR47、AtCOR6.6等均被强烈诱导。ABA信号通路相关基因AtRAB18和AtNCED3的表达也显著上调，提示MsPUB210的调控作用可能与ABA信号存在交汇。
4 讨论
本研究通过整合GRN导向的PPI分析、AF2结构预测与湿实验验证，系统阐明了紫花苜蓿U-box E3连接酶MsPUB210正调控耐冷性的分子机制。研究表明，MsPUB210通过其保守的U-box结构域与冷信号通路的核心转录因子MsICE1直接互作。这种互作很可能通过泛素化修饰调控ICE1的稳定性或活性，进而激活保守的ICE-CBF-COR信号级联反应，诱导大量下游冷响应基因（CORs等）的表达，共同增强植物的抗寒能力。同时，转基因植株中抗氧化酶系统的强化和渗透调节物质脯氨酸的积累，构成了其增强耐冷性的生理基础。此外，ABA通路相关基因的上调暗示了泛素化系统与多种胁迫信号通路之间存在复杂的交叉对话。该研究不仅首次明确了MsPUB210在紫花苜蓿冷适应中的积极功能，完善了植物PUB家族基因的功能图谱，也为利用分子育种手段改良紫花苜蓿等作物的耐寒性提供了新的理论依据和候选基因靶点。
5 结论
本研究鉴定并功能验证了紫花苜蓿中的一个新型U-box E3泛素连接酶基因MsPUB210。该基因能与转录因子MsICE1直接互作，作为正调控因子整合到ICE-CBF-COR冷信号通路中，通过增强抗氧化防御、维持膜稳定性和激活下游冷响应基因表达等多重机制，显著提高植物的耐冷性。这些发现深化了对植物泛素化修饰介导的非生物胁迫响应机制的理解，并为培育高耐寒性的紫花苜蓿品种奠定了重要的分子基础。
