在硝酸盐受限条件下，内生解淀粉芽孢杆菌N3通过调节生长素转运促进植物生长

《Frontiers in Plant Science》：Promotion of plant growth by endophyte Bacillus amyloliquefaciens N3 through modulation of auxin translocation under nitrate-limited conditions

本研究揭示了内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）N3在低氮（LN）条件下通过调控植物生长素（Auxin）转运与信号通路，有效促进侧根形成和植物生长的机制。研究证实N3通过抑制硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1表达、上调PIN-FORMED（PIN1, PIN3, PIN7）蛋白积累，促进侧根顶端生长素局部累积，并依赖于生长素响应因子（ARF7/ARF19）介导的转录调控。该机制在模式植物拟南芥和作物油菜、玉米中均得到验证，为开发低氮环境下的微生物肥料（biofertilizer）提供了新的理论依据和菌种资源。

　　

在硝酸盐受限条件下，内生解淀粉芽孢杆菌N3通过调节生长素转运促进植物生长

引言

植物的根系结构具有高度可塑性，能够优化养分吸收。侧根对增加根系吸收面积、觅取养分至关重要。硝酸盐转运蛋白1.1（NITRATE TRANSPORTER1.1, NRT1.1）在硝酸盐感知和生长素运输中发挥复杂作用，在低硝酸盐条件下，NRT1.1作为一种生长素转运体，促进生长素从侧根顶端向外（向基）运输，从而阻止生长所需的局部生长素积累，抑制侧根伸长。相反，在高硝酸盐条件下，NRT1.1蛋白在侧根原基中表达下调，允许生长素积累。除NRT1.1调控外，侧根原基中的生长素积累也受PIN1、PIN3和PIN7介导的生长素运输影响。这种局部生长素的积累加速了AUXIN/INDOLE-3-ACETIC ACID（Aux/IAA）蛋白的降解，从而解除对生长素响应因子（AUXIN RESPONSE FACTOR, ARF）蛋白的抑制。一旦被解除抑制，ARF7和ARF19等作为转录激活因子，启动侧根原基发育和随后突出所需转录程序。定殖于植物根系的细菌是植物生长的重要贡献者。芽孢杆菌属是土壤中的主要细菌属之一，已被确定为植物促生根际细菌，通过多种机制改善植物生长。然而，在硝酸盐限制条件下，有益细菌促进侧根生长的机制研究较少。本研究探索了解淀粉芽孢杆菌N3菌株在硝酸盐限制条件下对侧根发育的影响，并验证了其在土壤条件下对不同作物的效果，拓展了在硝酸盐受限环境中应用有益内生细菌潜力的理解。

材料与方法

研究所用植物材料包括拟南芥野生型Col-0，突变体nrt1.1、arf7、arf19，以及转基因株系pDR5:GFP、pPIN1:PIN1:GFP和pPIN7:PIN7:GFP。作物材料包括甘蓝型油菜品种中双11（ZS11）和玉米自交系B73。种子经消毒后，在含有不同浓度KNO₃（低氮LN: 0.19 g/L，全氮FN: 1.9 g/L）的琼脂平板上或土壤条件下生长。解淀粉芽孢杆菌N3在LB液体培养基中培养后，用无菌水重悬至OD₆₀₀= 0.1 ± 0.02用于接种实验。对于平板接种，将细菌悬浮液与指定培养基按1:10（v/v）比例混合。对于土壤接种实验，每周向根区接种15 mL细菌菌液。用平板扫描仪和ImageJ软件分析根系表型，用分析天平测量总生物量。通过Salkowski’s test检测细菌培养上清液中吲哚-3-乙酸（IAA）或其前体的存在，用水杨酸-浓硫酸比色法测定拟南芥植株中的硝酸盐含量。通过施加不同浓度（1, 2, 4 μM）的极性生长素运输抑制剂N-1-萘基邻氨甲酰苯甲酸（NPA）来阻断生长素极性运输。利用共聚焦显微镜观察pDR5:GFP、pPIN1:PIN1:GFP和pPIN7:PIN7:GFP转基因株系在侧根早期发育阶段的荧光信号。通过qRT-PCR分析相关基因表达水平。利用pUT-mini-Tn5-Kna-Tac-mCherry-SacB质粒构建mCherry标记的N3菌株，通过共聚焦显微镜观察其在根部的定殖。通过扫描电子显微镜观察N3在油菜根部的定殖。

结果

1. 解淀粉芽孢杆菌N3在硝酸盐受限条件下促进侧根形成和植物生长

与对照（Mock）相比，N3接种增加了拟南芥的侧根数量、侧根密度和总生物量，但不影响主根长度。这些效应在低氮条件下比在全氮条件下更为明显。在低氮条件下，接种N3的拟南芥植株硝酸盐含量显著高于对照组。构建的mCherry标记N3菌株的荧光信号在表皮和木质部组织的质外体空间中被强观察，在中柱鞘层的质外体中也检测到弱荧光信号，表明N3是一种内生细菌。N3的促进作用类似于外源生长素（NAA）处理的效果，但NAA处理的效果更为显著，且0.1 μM NAA降低了拟南芥植株的总生物量。Salkowski’s test显示N3具有IAA产生潜力，在培养48小时后产生最大量的IAA。这些结果表明生长素可能在N3塑造根系结构过程中发挥重要作用。

2. 接种N3后生长素相关基因表达上调

在低氮条件下，接种N3的植株中，涉及生长素运输的PIN1、PIN3和PIN7基因，以及调控生长素生物合成的黄素单加氧酶基因YUCCA1、YUCCA7、YUCCA8和色氨酸氨基转移酶基因TAA1，还有两个介导生长素响应调控的生长素响应因子基因ARF7和ARF19的表达水平均显著上调。这些结果表明N3处理在转录水平上改变了拟南芥植株的生长素生物合成、运输和生长素响应的ARF信号传导。

3. N3介导的侧根发育依赖于生长素运输和ARF功能

利用pDR5:GFP株系检测发现，与Mock植株相比，N3处理的根在木质部和侧根尖端（从第III期到突出期）的生长素信号显著增强。施用1至4 μM的NPA可逐步降低侧根密度，并且NPA处理完全消除了N3对侧根密度的促进作用，无论NPA浓度如何。在pPIN1:PIN1:GFP和pPIN7:PIN7:GFP转基因株系中，N3接种增强了PIN1和PIN7蛋白的积累，但这些效应在4 μM NPA处理时被削弱。因此，N3接种对侧根发育的促进作用依赖于生长素极性运输途径。在Col-0植株中，N3接种使侧根数量增加了84.9%，但这种效应在arf7或arf19突变体背景中被完全抵消。对于侧根密度，N3接种在arf7和arf19中引起的增加百分比（分别为57.3%和41.2%）低于在Col-0中（138.5%）。对于鲜重，N3在Col-0中增加了90.0%，但在arf7和arf19中仅分别增加了19.9%和13.6%。此外，表达分析显示，N3接种的Col-0植株中LBD16/ASL18的表达增强，这些效应在arf7中被减弱，在arf19中被消除。综上所述，N3对侧根结构的促进作用依赖于生长素运输和生长素响应的ARF信号传导。

4. NRT1.1对N3增强生物量至关重要

转录水平分析显示，N3处理在低氮条件下下调了几个硝酸盐转运蛋白基因的表达。NRT1.1是低氮条件下负责根系发育的关键基因。在接种实验中，nrt1.1突变体中侧根密度的促进作用（75.9%）低于Col-0（164.7%）。对鲜重的促进作用在nrt1.1突变体（23.2%）中也弱于Col-0（74.6%）。这表明NRT1.1在N3接种期间鲜重调控中具有显著但部分的作用。由于上述结果表明N3介导的侧根形成调控完全依赖于生长素运输和生长素响应ARF介导的通路，推测NRT1.1可能作用于生长素相关基因的上游。正如预期，N3接种和Mock植株之间PIN1、PIN3和PIN7的表达差异在nrt1.1中比在Col-0中相对较小。具体来说，PIN1在nrt1.1中的表达水平在Mock和接种植株之间没有差异，这与在Col-0植株中发现的显著差异不同。因此，N3对生长素运输的影响部分依赖于NRT1.1。

5. N3有效促进油菜和玉米的生长

在平板实验中，N3处理在低氮条件下显著增加了油菜的侧根数量和密度。在低氮和全氮条件下，接种N3的植株根和地上部鲜重均显著增加。在土壤栽培条件下也评估了N3的效果。通过扫描电子显微镜验证了N3在油菜根部的定殖。对于油菜，在不同接种天数后检测到株高、叶面积以及地上部和根的鲜重均有所增加。这些促进效应在低氮条件下比在全氮条件下更为明显，特别是鲜重性状。对于单子叶植物玉米，接种N3后地上部和根的鲜重均显著增加。这些结果表明N3细菌在土壤条件下对不同作物植株具有一致且稳定的促进效果。

讨论

在低硝酸盐条件下，N3显著增加了拟南芥的侧根数量、侧根密度和硝酸盐含量。N3具有固氮活性，但本研究表明，N3接种抑制了NRT1.1的表达并促进了侧根发育，这与直接施用外源硝酸盐（可诱导硝酸盐转运蛋白基因表达并引发侧根伸长）的效应不同。因此，N3引起的生长素运输变化更可能是增强根系、增加硝酸盐吸收和增强生物量积累的原因。NRT1.1被报道为低硝酸盐可用性下侧根生长的抑制因子，通过促进向基生长素运输。本研究显示，N3接种在转录水平上抑制了NRT1.1表达，且nrt1.1突变部分减弱了N3诱导的侧根密度和鲜重增加。这些结果表明NRT1.1的抑制至少部分促成了N3对侧根发育的促进作用。除了NRT1.1，还观察到N3处理后PIN1和PIN7蛋白积累增强，表明PIN介导的生长素运输也得到加强。因此，N3似乎通过协调调控多种运输成分来调节生长素分布。值得注意的是，arf7或arf19突变并未完全损害N3的促进作用，这表明存在超出ARF7/ARF19依赖性信号传导的额外机制。NRT1.1在有限硝酸盐条件下作为生长素转运体发挥作用，改变NRT1.1依赖性生长素运输也可能有助于侧根尖端的生长素积累。此外，N3接种显著诱导了多个生长素生物合成基因的表达，包括YUCCA1、YUCCA7、YUCCA8和TAA1。这与之前的发现一致，即在yuc1D突变体中组成型过表达YUCCA1会提高IAA水平并增强侧根形成。因此，N3触发的生长素生物合成增加可能是N3诱导侧根起始的另一个重要机制。总的来说，这些发现表明N3通过协调调节生长素生物合成、生长素运输和生长素响应ARF信号传导来促进侧根发育，从而重塑局部生长素稳态以利于侧根形成。虽然mCherry标记的N3主要定位于表皮和木质部细胞的质外体空间，但在中柱鞘层的质外体中也检测到弱荧光信号。由于侧根起源于木质部极附近的中柱鞘细胞，N3在该细胞层附近的定殖表明细菌定殖与侧根起始位点之间存在潜在的空间关联。在低氮条件下，N3的促生长效应表现出明显的时序模式。接种后14天，虽然植株高度和地上部鲜重没有显著增加，但叶面积和根鲜重在此早期阶段已显著增强。相比之下，地上部生物量的显著增加在21天和35天时变得明显。这种顺序响应表明，早期刺激根系生长可以改善养分获取能力，随后支持地上部生物量积累。这种时间依赖性增强与根系调节是氮限制下的初始适应策略的观点一致，最终导致整体植物性能的改善。虽然解淀粉芽孢杆菌SQR9的挥发性化合物促进侧根发育，但本研究表明N3是一种内生菌，因为它被检测到存在于质外体和维管束中。N3促进固氮和硝酸盐在低氮条件下被根系吸收。尽管对拟南芥具有促生长效应，但本研究也揭示了其对双子叶作物甘蓝型油菜和单子叶作物玉米的一致效应。因此，内生菌N3在作为微生物肥料应用方面可能具有巨大潜力。总之，本研究证明N3在低氮条件下促进侧根发育并增强植物生长。从机制上讲，N3介导的促生长依赖于生长素运输和ARF功能，并伴有生长素生物合成相关基因的转录变化。基于土壤的实验进一步证实N3在农学相关背景下改善了植物性能。这些发现共同为有益根际细菌与生长素调控的根系发育在氮限制下的相互作用提供了新的见解。