《Frontiers in Immunology》：Endothelial cells regulate mesangial cells through the Dll4/Notch3 axis to participate in glomerular injury in lupus nephritis
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本研究表明，在狼疮肾炎（LN）的进展过程中，肾小球内皮细胞（ECs）呈现异质性，其中EC-1亚群通过分泌Dll4激活系膜细胞（MCs）的Notch3通路，从而驱动MC的增殖与迁移，参与肾小球损伤。这项研究揭示了EC调控MC的关键分子轴（Dll4/Notch3），为LN的治疗策略提供了新的候选靶点。
内皮细胞在狼疮肾炎中的异质性及其对系膜细胞的调控
狼疮肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）常见且严重的肾脏并发症，其发病机制复杂，涉及肾脏固有细胞的异常激活与相互作用。肾小球内皮细胞（ECs）和系膜细胞（MCs）是肾小球内的重要细胞成分，两者紧密相邻，共同维持肾小球滤过屏障的结构与功能。然而，在LN进程中，ECs如何变化，以及其与MCs之间的通讯机制，尚未完全阐明。本研究结合单核RNA测序（snRNA-seq）技术、体外细胞实验及临床样本分析，系统探讨了ECs的异质性及其通过Dll4/Notch3轴调控MCs在LN肾小球损伤中的作用。
狼疮肾炎小鼠肾脏中内皮细胞的亚群分析
研究人员利用自发性狼疮模型MRL/lpr小鼠，分别在其疾病早期（6周龄）和进展期（10周龄）获取肾脏组织进行snRNA-seq分析。结果显示，与6周龄小鼠相比，10周龄LN小鼠肾脏中ECs的数量显著增加。通过无监督聚类分析，从8398个ECs中鉴定出5个转录组学特征不同的亚群（EC-0至EC-4）。其中，EC-0和EC-1亚群的比例随疾病进展而增加，尤以EC-1亚群的增加最为显著。EC-1亚群的标志基因包括Pi16等，基因本体（GO）富集分析提示该亚群主要参与“蛋白质代谢过程的细胞调控”。进一步的免疫荧光共定位染色证实，在LN小鼠肾脏中，表达Pi16的EC-1细胞数量随疾病进展而明显增多，这与测序结果一致。
内皮细胞亚群与系膜细胞之间的通讯网络
为了探究ECs各亚群与其他肾小球细胞，特别是MCs之间的相互作用，研究团队利用CellphoneDB软件进行了细胞间通讯分析。结果显示，在ECs的各个亚群中，EC-1与MCs之间存在强烈的配体-受体相互作用关系。进一步的配体-受体对分析发现，EC-1高表达配体Dll4（Delta-like ligand 4），而MCs则表达其潜在受体Notch3。免疫荧光共染色实验在组织层面验证了这一发现：在LN小鼠肾脏中，Dll4与EC-1标志物Pi16存在共定位；同时，Notch3与MCs的经典标志物Fn1也存在共定位。这些结果提示，EC-1可能通过分泌Dll4，与MCs表面的Notch3受体结合，从而激活下游信号。
Dll4通过Notch3促进系膜细胞的增殖与迁移
为了在功能上验证上述猜想，研究人员进行了一系列体外实验。首先，用脂多糖（LPS）刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）模拟炎症激活，发现ECs的Dll4表达和分泌均增加。随后，用重组Dll4蛋白直接处理小鼠系膜细胞系（SV40-MES-13）。结果发现，Dll4处理能显著促进MCs的活力、增殖（通过CCK-8和EdU实验检测）以及迁移能力（通过划痕愈合实验和Transwell实验检测）。在分子机制上，Dll4处理上调了MCs中Notch3下游靶基因（如Hey1, Hey2）的mRNA和蛋白表达，表明Notch3通路被激活。
为了确认Dll4的作用是通过Notch3介导的，研究引入了Tarextumab（一种人源化抗Notch2/3抗体，可特异性抑制Notch3）。实验表明，Tarextumab能够有效拮抗Dll4引起的MCs增殖、迁移以及Notch3下游信号分子的上调。这些结果强有力地证明，Dll4正是通过激活MCs上的Notch3受体，来调控其病理表型。
干扰Dll4/Notch3轴可抑制内皮细胞调控的系膜细胞表型
为了在更接近生理的细胞互作环境中验证上述轴心，研究建立了ECs与MCs的Transwell共培养体系。在该体系中，用LPS预处理ECs以诱导其活化。随后，通过小干扰RNA（siRNA）在ECs中敲低Dll4的表达，或在MCs中加入Notch3抑制剂Tarextumab。
结果显示，无论是敲低ECs中的Dll4，还是在MCs中加入Tarextumab，都能显著抑制共培养体系中MCs的迁移和增殖能力。这直接证实了，活化的ECs通过分泌Dll4，作用于MCs的Notch3，从而驱动MCs的病理行为。
Dll4表达与狼疮肾炎患者疾病活动度的相关性
最后，研究将发现延伸至临床层面。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测无肾脏受累的SLE患者和LN患者血清中的Dll4水平，发现两组患者的血清Dll4水平均显著高于健康对照者。更重要的是，在LN患者中，处于疾病活动期患者的血清Dll4水平明显高于非活动期患者，受试者工作特征（ROC）曲线分析表明血清Dll4对区分LN活动状态具有良好的预测价值。此外，对LN患者肾活检组织进行免疫荧光染色发现，其肾小球血管ECs中的Dll4表达量显著高于相对健康的对照肾组织。这些临床数据共同表明，Dll4的表达与LN的疾病活动度密切相关。
总结与展望
综上所述，本研究通过整合snRNA-seq、功能实验和临床验证，系统描绘了LN进程中肾脏ECs的异质性图谱，并首次揭示了一个新的细胞间调控轴：活化的ECs，特别是EC-1亚群，通过分泌Dll4配体，激活相邻MCs上的Notch3受体，从而驱动MCs的异常增殖与迁移，最终参与肾小球损伤和LN的进展。机制示意图清晰展示了这一调控过程 。
本研究不仅深化了对LN肾小球内细胞互作网络的理解，更重要的是，将Dll4/Notch3轴确立为一个潜在的治疗干预靶点。抑制剂Tarextumab在体外表现出的显著抑制效果，为未来开发针对该通路的LN治疗策略提供了重要的临床前依据。当然，本研究也存在一定局限性，例如体外刺激使用了非LN特异的LPS，且缺乏体内实验的直接验证。未来的研究需要在LN动物模型中进行体内功能验证，并探索使用更贴近LN病理的刺激物（如免疫复合物），以进一步夯实Dll4/Notch3轴在LN发病中的核心地位及其转化医学价值。
