综述：利用形态建成调控因子和肽类再生因子提升植物转化与基因组编辑的研究进展

《Frontiers in Plant Science》：Advances in the use of morphogenic regulators and peptide regenerating factors for boosting plant transformation and genome editing

本文系统综述了利用形态建成调控因子（MRs）和肽类再生因子（如REF1）克服植物遗传转化与基因组编辑瓶颈的最新进展。文章首先剖析了传统植物再生体系（如农杆菌、基因枪、病毒载体、RNP递送）的局限，进而深入阐释了BABY BOOM (BBM)、WUSCHEL (WUS/WOX)、GRF-GIF嵌合体、LEAFY COTYLEDON (LEC)、SERK、WIND1、REF1等核心MRs与肽类的分子机制及其在促进体细胞胚发生、器官发生和细胞全能性重编程中的关键作用。综述还探讨了通过组织特异性、诱导型、瞬时表达及可切除系统等策略，在玉米、水稻、小麦、大豆、番茄、木薯等多种单双子叶及难转化作物中高效部署这些因子，以显著提升转基因和基因编辑（包括CRISPR-Cas9/12a、碱基编辑、引导编辑）效率的实践方案，并展望了其未来在突破基因型依赖、简化培养流程、推动精准育种方面的巨大潜力。

　　

植物，尤其是许多具有重要经济价值的作物，其遗传转化和植株再生一直是制约转基因和基因组编辑技术应用的重大瓶颈。传统的_{in vitro}转化方法严重依赖对培养介质和组份的手动优化，且过程耗时、基因型依赖性高、易产生体细胞无性系变异，效率低下。近年来，研究焦点已转向利用植物内在的形态建成调控因子和新型肽类再生因子，它们能够重编程体细胞命运，使其恢复到全能性状态，从而革命性地提升植物转化和编辑效率。

基因编辑技术的革新与递送方法

基因组编辑的核心工具是序列特异性核酸酶。从早期的锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN），到如今主流的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）系统，技术不断迭代。CRISPR-Cas9和Cas12a (Cpf1)因其简单、高效、成本低而广泛应用。在此基础上，碱基编辑器（CBE, ABE）能够实现精确的碱基替换，而引导编辑器（PE）则能完成所有12种可能的碱基替换以及特定插入缺失，极大地扩展了编辑能力。

将这些编辑组件递送到植物细胞是另一关键步骤。农杆菌介导的转化经过多年改进，通过使用“超强毒力”菌株、三元载体系统（如pVir）以及辅助质粒（如pVS1-VIR2）来增强转化效率。基因枪（生物轰击）法则是难转化作物的替代方案，但其优化参数复杂且可能造成染色体损伤。病毒载体（如烟草脆裂病毒TRV、大麦条纹花叶病毒BSMV）能够高效递送编辑组件，但系统性修饰和可遗传性有限。此外，将预组装的核糖核蛋白复合物（RNP）通过聚乙二醇（PEG）转染原生质体或基因枪递送，可以产生无转基因的编辑事件，减少脱靶效应。

形态建成调控因子的核心作用机制

植物再生本质上是一个形态建成过程，受一系列转录因子和信号分子精密调控。这些形态建成调控因子（MRs）通过调控生长素和细胞分裂素的生物合成与信号通路，主导细胞分化、胚胎发生、器官发生和分生组织特性。

WUSCHEL (WUS) 与 WOX 家族：WUS是同源域转录因子，对维持茎尖分生组织（SAM）的干细胞群至关重要。其过表达能促进多种植物的体细胞胚胎发生。例如，玉米^ZmWUS2与^ZmBBM共表达，可显著提高玉米多个自交系的转化效率，使之前难以转化的基因型实现高达20倍的芽再生增加。但持续高表达^WUS可能导致胚胎组织易碎和发育异常。因此，策略上常使用弱启动子（如玉米生长素诱导型启动子Axig1）控制其表达，或通过可切除系统（如CRE-loxP）在转化后移除该基因。小麦^TaWOX5也能克服基因型依赖性，显著提升小麦、黑麦、大麦和玉米的转化效率。

BABY BOOM (BBM)：BBM属于AP2/ERF转录因子超家族，是细胞全能性和体细胞胚胎发生的关键调节因子。其异位表达可在无需外源植物生长调节剂或胁迫条件下诱导体细胞胚胎发生。在玉米、高粱、水稻、可可、辣椒等多种作物中，^BBM过表达均被证明能增强体细胞胚胎发生和转化效率。与^WUS类似，其持续表达也可能导致表型异常。将^BBM（由强启动子PLTP驱动）与^WUS2（由弱诱导型启动子驱动）组合使用，成为在多种精英玉米品种中实现高效转化的经典策略。

GRF-GIF 嵌合体：生长调节因子（GRF）与GRF互作因子（GIF）形成的复合物，能招募染色质重塑复合物，促进染色质开放和转录，从而促进细胞分裂。研究发现，表达对miR396具有抗性的小麦^TaGRF4与^TaGIF1的嵌合体，能显著提高小麦未成熟胚的再生和转化效率（约7.8倍），且不产生不良表型，能获得可育的转化植株。这种嵌合体策略在单子叶植物（小麦、玉米、高粱）和双子叶植物（柑橘、葡萄、大豆、番茄、生菜）中均显示出普适性和有效性。

其他重要调控因子：

• •
  LEAFY COTYLEDON (LEC)：^LEC1、^LEC2和^FUS3是胚胎发育和成熟过程的核心转录因子。异位表达^LEC2可诱导拟南芥产生体细胞胚。
• •
  SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK)：属于富含亮氨酸重复序列受体样激酶（LRR-RLK）家族，在体细胞胚胎发生中起重要作用。过表达^AtSERK1可增强拟南芥体细胞胚胎形成。
• •
  AGAMOUS-LIKE15 (AGL15)：MADS-box蛋白，在拟南芥和大豆中促进体细胞胚胎发生。
• •
  LAX PANICLE1 (LAX1)：碱性螺旋-环-螺旋转录因子，参与腋生分生组织形成。过表达小麦^TaLAX1可提高小麦、玉米和大豆的再生频率。

肽类再生因子的新兴力量

小肽信号分子在植物再生中扮演着越来越重要的角色。

• •
  WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION 1 (WIND1)：属于AP2/ERF家族，是伤口诱导细胞重编程的关键调节因子。它通过直接激活茎尖分生组织调节因子^ESR1来促进愈伤组织形成和器官发生。拟南芥^AtWIND1在油菜中的异位表达，使下胚轴段的芽再生率提高了24-47倍。
• •
  REGENERATION FACTOR 1 (REF1)：这是一种植物源性多肽，作为局部伤口信号分子，在组织再生中发挥关键作用。REF1通过与其受体PORK1结合，激活下游MAPK级联反应，导致^WIND1表达，从而形成“REF1-PORK1-WIND1”正反馈环路，增强再生信号。外源施加REF1肽能以剂量依赖的方式显著促进番茄、辣椒、玉米、大豆和小麦的愈伤组织形成和芽再生，为解决难转化作物的再生瓶颈提供了全新方案。
• •
  CLE 肽：CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED肽家族主要起负调控作用。例如，^CLE1-^CLE7和^CLE9/10肽会抑制^{de novo}芽再生。突变^cle1–7七重突变体或施用CLE肽抑制剂，可以解除其对^WUSCHEL表达的抑制，从而提高再生效率。

MRs与肽类因子的应用策略与前景

为了在利用MRs益处的同时避免其副作用，研究人员开发了多种部署策略：

1. 1.
   组织特异性与诱导型表达：使用在胚胎或分生组织特异性或激素/化学诱导的启动子驱动MRs表达，仅在需要再生时激活。
2. 2.
   瞬时表达与“利他转化”：将MRs构建在不起整合的载体上，使其在转化细胞中瞬时表达，通过其非细胞自主移动性促进邻近细胞增殖再生，从而获得不含MRs转基因的植株。
3. 3.
   可切除系统：将MRs构建在两个重组酶位点之间，在转化完成后通过诱导重组酶表达将其从基因组中切除，获得正常的T0代植株。
4. 4.
   外源肽处理：将REF1等活性肽直接添加到培养介质中，无需基因操作即可增强再生，简化流程并避免遗传修饰。

结论与展望

利用形态建成调控因子和肽类再生因子是突破植物转化和基因组编辑瓶颈的革命性途径。通过深入理解^BBM、^WUS、^GRF-GIF、^REF1等关键因子的分子机制，并巧妙运用组织特异性、诱导型、瞬时或可切除表达策略，以及外源肽处理，研究人员已成功将转化和编辑技术拓展到许多之前难以操作的作物和基因型。未来，结合新型递送技术（如纳米颗粒）、发现更多作物特异性的高效MRs组合、以及优化再生肽的应用方案，将进一步推动精准育种技术的发展，为培育抗逆、高产、优质的作物新品种，保障全球粮食安全提供强大工具。