光化学内化增强PD-L1-SAP免疫毒素在非小细胞肺癌细胞系中的疗效

《Frontiers in Immunology》：Photochemical enhancement of PD-L1-SAP immunotoxin efficacy in non-small cell lung cancer cell lines

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）对免疫检查点抑制剂（ICI）产生耐药性的难题，提出了创新的“光化学内化（PCI）”联合疗法。研究表明，利用光控技术可显著增强靶向PD-L1的免疫毒素（anti-PD-L1-SAP）的胞内递送与杀伤效力，为克服ICI耐药、拓宽NSCLC免疫治疗策略提供了新的体外概念验证。

　　

文章内容归纳总结

摘要

针对程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）轴的免疫检查点抑制剂（ICI）耐药，仍是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的主要障碍。为解决此问题，本研究探索了光化学内化（PCI）——一种光控的内体逃逸技术，作为增强靶向PD-L1免疫毒素（anti-PD-L1-SAP）细胞内递送和效能的策略。结果发现，对高表达PD-L1的NCI-H1975细胞和低表达PD-L1的A549细胞施加PCI，能显著增强细胞毒性，前者仅需皮摩尔（30 pM）级别的浓度即可起效，而后者需更高剂量（1000 pM）才能达到类似效果。特异性通过受体阻断和非靶向对照实验得到证实。共聚焦显微镜证实anti-PD-L1-SAP定位于溶酶体和内体，流式细胞术显示其存在时间依赖性的细胞内积累，这与PCI需先将药物“囚禁”于内体、再经光照释放的原理一致。重要的是，与免疫检查点抑制剂阿特珠单抗（Atezolizumab, Tecentriq^?）联用会降低PCI在PD-L1^high细胞中的疗效，凸显了受体可及性的重要性。结论表明，PCI可增强PD-L1靶向生物制剂的递送和活性，或有助于克服耐药机制。总体而言，PCI拓宽了PD-L1靶向免疫毒素的治疗窗口，可补充现有免疫疗法，支持在NSCLC中进行进一步的临床前评估。

1 引言

靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（ICI）已改变了包括NSCLC在内的多种癌症的治疗格局。然而，相当大比例的患者初始无应答或后续产生获得性耐药。耐药机制具有多因素性，包括肿瘤内在因素（如抗原呈递缺陷、JAK1/2突变等）和肿瘤微环境（TME）的免疫抑制。这凸显了开发新策略以克服此挑战的迫切需求。

光化学内化（PCI）是一种新兴的光控药物递送技术，旨在增强那些通常被困在内体和溶酶体中的大分子药物的细胞内递送。它基于光动力疗法（PDT）原理，利用两亲性光敏剂（如fimaporfin, TPCS_2a）选择性聚集在内溶酶体区室。光激活后，PCI光敏剂产生活性氧（ROS），破坏内溶酶体膜的完整性，从而促进治疗性载荷释放到细胞质中，增强疗效。与旨在通过ROS直接损伤诱导细胞死亡的PDT不同，PCI旨在促进ROS诱导的内体去稳定化，从而改善药物的细胞内递送。

核糖体失活蛋白（RIPs），特别是I型RIPs如皂草素（saporin），是PCI递送的有吸引力的载荷。这些蛋白质能酶学失活核糖体，导致蛋白质合成不可逆抑制和细胞死亡。皂草素可通过内吞作用进入细胞，但由于其无法逃逸内体，除非与PCI等内体逃逸策略结合，否则其效力有限。通过与肿瘤特异性单克隆抗体偶联，RIPs可被靶向至癌症相关抗原，提高选择性和细胞毒性潜力。

有研究证明PD-L1可通过内吞作用内化。近期研究也显示，靶向PD-L1的单克隆抗体阿特珠单抗会被NSCLC细胞内吞，并通过CD63阳性细胞器转运至溶酶体。此前，靶向PD-L1的新型免疫毒素anti-PD-L1-SAP已在乳腺癌模型中显示出作为PCI兼容药物的前景。

临床前研究表明，PCI可显著增强大分子药物（包括化疗药和毒素偶联抗体）的疗效。基于fimaporfin的PCI已在多项临床试验中进行测试，在头颈鳞状细胞癌、胆管癌等疾病中显示出安全性和初步疗效。

本研究提供了体外概念验证，表明光化学内化可增强靶向PD-L1的免疫毒素在NSCLC中的细胞内递送和细胞毒活性。为确定PCI如何有效增强对PD-L1表达细胞的选择性靶向，我们研究了两种PD-L1丰度差异显著的NSCLC模型：NCI-H1975（PD-L1^high）和A549（PD-L1^low）。我们评估了免疫毒素的细胞毒性、PDT和PCI疗效，并详细分析了PD-L1结合、内化动力学以及靶向PD-L1的单克隆抗体阿特珠单抗的亚细胞定位。

2 材料与方法

使用了人NSCLC细胞系NCI-H1975（CRL-5908）和A549（CCL-185）。光敏剂为二磺化四苯基二氢卟酚（TPCS_2a, fimaporfin）。免疫毒素为PD-L1-SAP（Anti-PD-L1-SAP），由靶向人PD-L1的小鼠单克隆抗体与链霉亲和素-皂草素（streptavidin-saporin）二级偶联物组成。非特异性对照为生物素化小鼠IgG与链霉亲和素-皂草素的偶联物（BIgG–SAP）。

PCI实验采用两种流程。流程I：细胞与TPCS_2a和anti-PD-L1-SAP共孵育18小时，清洗后在无药培养基中孵育4小时（追逐期），然后进行光照。流程II：细胞先与TPCS_2a单独孵育18小时；在随后的4小时追逐期内，加入anti-PD-L1-SAP使其在内化前被摄取，然后进行光照。使用LumiSource灯（发射峰435 nm）作为光源进行照射。

为研究阿特珠单抗是否调节PCI疗效，在流程II基础上，细胞在用TPCS_2a预处理18小时后，用阿特珠单抗（100 nM）预孵育30分钟以阻断PD-L1受体，然后更换为同时含有阿特珠单抗和anti-PD-L1-SAP的培养基继续孵育4小时，之后清洗并进行光照。

细胞毒性通过MTS法在照射后48小时测定代谢活性来评估。通过共聚焦显微镜和流式细胞术研究PD-L1的结合、摄取和亚细胞定位。使用生物素化抗人PD-L1抗体和Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素进行染色，并用LysoTracker Blue标记溶酶体。共定位通过皮尔逊相关系数（PCC）和曼德尔重叠系数（MOC）进行量化。统计分使用GraphPad Prism进行。

3 结果

3.1 TPCS_2a在肺癌细胞系中的光毒性

为建立PCI的最佳条件，首先评估了TPCS_2a在NCI-H1975和A549细胞中的光毒性。PD-L1^high的NCI-H1975细胞比PD-L1^low的A549细胞对PDT更敏感。基于此，后续PCI实验选择TPCS_2a浓度为：NCI-H1975用0.2 μg/mL，A549用0.5 μg/mL。

3.2 anti-PD-L1-SAP和非特异性BIgG-SAP免疫毒素的细胞毒性

评估了在无光敏剂和光照条件下，靶向PD-L1的免疫毒素和非特异性皂草素偶联抗体的细胞毒性。非靶向免疫毒素BIgG-SAP和游离皂草素在两种细胞系中于测试浓度范围内均未降低细胞活力。在PD-L1^low的A549细胞中，anti-PD-L1-SAP也未降低活力。相反，在PD-L1^high的NCI-H1975细胞中，anti-PD-L1-SAP呈剂量依赖性降低活力，在100 pM和1000 pM时分别降低31%和63.5%。其IC₅₀值为0.29 ± 0.09 nM。缩短至4小时的孵育时间，anti-PD-L1-SAP在NCI-H1975细胞中仅引起适度的活力降低。

3.3 抗人PD-L1-SAP的PCI细胞毒效应

基于前述结果，接下来评估了PCI靶向递送PD-L1特异性免疫毒素的疗效。使用流程I（共孵育18小时），在PD-L1^high的NCI-H1975细胞中，30 pM和100 pM的anti-PD-L1-SAP与对照组相比，细胞毒性显著增加。然而，免疫毒素本身也会降低细胞活力。相比之下，PD-L1^low的A549细胞需要更高浓度（1000 pM）的anti-PD-L1-SAP才能达到相当的PCI效果。

使用流程II（TPCS_2a预孵育18小时，anti-PD-L1-SAP孵育4小时），在NCI-H1975细胞中使用1000 pM的anti-PD-L1-SAP也能实现PCI疗效。但在A549细胞中，此流程的PCI效果比流程I低2倍（基于IC₅₀值）。

3.4 阿特珠单抗对PCI疗效的调节

在PD-L1^high的NCI-H1975细胞中，与阿特珠单抗共处理显著降低了初始90秒照射期间的PCI效果。由此产生的细胞毒性谱与单独PDT非常相似，表明阿特珠单抗竞争性阻断PD-L1结合位点，从而限制了免疫毒素的摄取和细胞内递送。相反，在A549细胞中未观察到PCI疗效的显著降低，表明较低的PD-L1表达可能减弱了受体阻断在这些条件下的影响。

3.5 抗PD-L1抗体的细胞内定位和运输

荧光成像显示PD-L1从质膜逐渐内化到细胞内区室。在早期时间点（0.5–2小时），anti-PD-L1-Alexa647主要定位于PD-L1^high的NCI-H1975细胞的质膜。随时间推移（2–18小时），PD-L1信号逐渐向细胞内区室转移，与溶酶体的共定位增加。定量分析支持这些观察结果。30分钟时，PD-L1与质膜有很强的共定位，皮尔逊相关系数为0.71 ± 0.01，在18小时后下降至0.14 ± 0.04。同时，PD-L1与溶酶体的共定位随时间增加，皮尔逊系数从30分钟时的0.17 ± 0.04上升至18小时时的0.64 ± 0.02。这些结果表明PD-L1的逐渐内化和溶酶体运输。

在PD-L1^low的A549细胞系中，PD-L1运输并未遵循随时间溶酶体积累的严格递进模式。与溶酶体的共定位在4小时达到峰值，随后下降。而与质膜的共定位随时间稳步下降。共聚焦显微镜证实NCI-H1975细胞的PD-L1表达水平显著高于A549细胞。在NCI-H1975细胞中，前2小时观察到与质膜的强共定位，而在A549细胞中，膜共定位较弱并降至几乎无法检测的水平。

3.6 NSCLC细胞中抗PD-L1抗体摄取的时间分辨流式细胞术分析

流式细胞术用于量化抗PD-L1抗体在NCI-H1975和A549细胞中多个时间点的结合和摄取。中位荧光强度（MFI）显示，在所有时间点，NCI-H1975细胞的抗体相关信号水平始终高于A549细胞，差异达数个数量级。这些结果证实了NCI-H1975是PD-L1^high细胞系，而A549是PD-L1^low模型。在18小时孵育后进行4小时追逐后，PD-L1相关荧光保持稳定，与连续18小时孵育相比无显著降低。这表明与PD-L1结合的抗体随时间保持结合状态，支持了在光激活前进行清洗步骤的PCI方案的可行性。

4 讨论

本研究探讨了将光化学内化（PCI）与靶向PD-L1的免疫毒素anti-PD-L1-SAP相结合在非小细胞肺癌（NSCLC）模型中的治疗潜力。数据清楚地表明，PCI增强的PD-L1靶向免疫毒素递送是针对PD-L1阳性NSCLC细胞的高效细胞毒靶向策略。在PD-L1^high的H1975细胞系中，仅皮摩尔浓度的免疫毒素就足以诱导强大的PCI介导的细胞毒反应。有趣的是，PD-L1^low的A549细胞也对PCI治疗有反应，尽管需要10倍更高浓度（纳摩尔范围）的免疫毒素才能达到可比的效果。将免疫毒素孵育时间缩短至4小时，导致H1975细胞的效力显著下降，有效浓度转移至纳摩尔范围。这表明足够的细胞摄取和免