《Frontiers in Microbiology》：Isolation, screening, and optimization of the fermentation conditions for endophytic bacteria CHR2-1 of Capparis hainanensis
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本文是一项关于利用植物内生细菌进行生物防治的原创性研究。研究从我国特有的药用植物海南山柑（Capparis hainanensis）中分离筛选出一株具有广谱抑菌活性的内生细菌CHR2-1，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株不仅能有效抑制香蕉枯萎病（Fusarium wilt）等多种植物病原真菌，还能显著促进香蕉幼苗生长，展现出“一菌多效”的潜力。研究进一步通过响应面法（Response surface methodology）优化了其发酵条件，为开发新型、环保的生物农药提供了坚实的理论与实验基础。
1 引言
随着化学农药的过度使用导致农产品农药残留超标、环境污染和生态失衡等问题日益严峻，植物病害的绿色防控技术已成为全球农业可持续发展的重要研究方向。生物防治通过利用生物活性物质或微生物间的拮抗作用来防控病害，具有环境友好、不易产生抗药性等优势，近年来在农业和林业领域展现出巨大潜力。其中，内生菌因其独特的生态功能成为研究热点。研究表明，内生菌可通过分泌抗菌物质、竞争生态位、诱导植物系统抗性（ISR）及合成植物激素（如IAA、GA）等多种机制抑制病原菌并促进宿主植物生长。特别是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种被广泛研究的生防因子，能够通过直接拮抗和诱导宿主抗性来抑制土传和叶部病害。然而，从独特生态位（如海南山柑）分离的菌株可能具有新的机制或更强的功效。本研究旨在从海南山柑中分离、筛选具有生防潜力的内生细菌，评估其对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉幼苗的促生作用，并通过优化发酵条件，为开发源于特有药用植物的新型生防制剂提供理论基础。
2 材料与方法
2.1 海南山柑内生菌的分离、培养与纯化
采用表面消毒法，对来自海南省三亚市崖城区（N 18°23'43", E 109°10'32"）的海南山柑新鲜根、茎、叶组织进行处理。样品经75%酒精和0.1%升汞溶液消毒、无菌水冲洗后，将组织块压入马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、营养琼脂（NA）和高氏一号琼脂平板，在25-28°C下培养3-5天。同时设置未消毒组织块和最后冲洗水的平板作为阴性对照，以确保表面消毒彻底。对长出的内生真菌采用尖端培养法纯化，内生细菌和放线菌采用划线法纯化，纯化菌株保存于相应斜面备用。
2.2 内生菌的拮抗活性测定
采用对峙培养法评价分离菌株的拮抗活性。靶标真菌包括香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Foc， ATCC 76255）等8种常见植物病原真菌。将目标真菌菌饼接种于PDA平板中央，在其两侧约2 cm处用接种环划两条内生细菌条带（终浓度1×106孢子/mL），以不接内生菌的平板为空白对照。培养3天后，采用十字交叉法测量真菌菌落直径，并按公式计算抑菌率。
2.3 内生细菌CHR2-1的鉴定
对抑菌效果最优的菌株CHR2-1进行形态学、生理生化特性鉴定，并通过PCR扩增16S rDNA序列进行系统发育分析。采用引物F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，扩增产物测序后在GenBank数据库中进行BLAST比对，并使用MEGA5.10软件的邻接法构建系统发育树。
2.4 CHR2-1对孢子萌发的影响测定
采用孢子萌发法测定CHR2-1的无菌发酵滤液对5种植物病原真菌孢子萌发的抑制率。将LB和NA培养基中培养的CHR2-1发酵液离心、过滤后，与孢子悬浮液混合于凹玻片上培养8-12小时，显微镜下观察并统计孢子萌发率，计算孢子萌发抑制率。
2.5 CHR2-1防治香蕉枯萎病的盆栽试验
在温室中进行盆栽试验。将香蕉幼苗种植于灭菌土中，14天后用CHR2-1菌悬液（109cfu/mL）灌根处理，4天后在根部接种Foc菌液。以无菌水和95%恶霉灵可湿性粉剂（1200倍液）分别作为空白对照和化学药剂对照。分别在接种病原菌后14、22、30天调查发病情况，记录病级，计算病情指数和防治效果。香蕉枯萎病的分级标准参照文献修改，分为0级（健康）至6级（整体枯萎死亡）。
2.6 CHR2-1对香蕉幼苗的促生作用测定
在盆栽试验中，于香蕉苗移栽15天和施用CHR2-1菌悬液45天后，分别测量香蕉苗的株高和茎粗。45天后，将香蕉植株分为地上部和地下部，分别称量鲜重，计算CHR2-1处理对香蕉生长的促进效果。
2.7 CHR2-1培养条件的优化
对CHR2-1的培养温度、碳源、氮源和pH值进行单因素优化。分别测定不同温度、不同外源碳源、不同氮源以及不同初始pH值的LB培养基中，CHR2-1培养24小时后的OD630值，以确定其最适生长条件。
2.8 CHR2-1发酵条件的优化
在单因素优化的基础上，采用二次通用旋转组合设计，以蛋白胨、蔗糖、硝酸钾和氯化钠四个因素为变量，以CHR2-1发酵滤液对Foc的抑菌圈直径为响应值，进行发酵培养基配方的优化。通过DPS数据处理系统对试验数据进行拟合，建立回归模型，并进行方差分析和效应分析，以确定最优的发酵条件组合。
3 结果与讨论
3.1 内生细菌的分离与拮抗活性
从海南山柑的根、茎、叶组织中总共分离到15株内生细菌，其中6株显示出良好的拮抗活性。如表2所示，从根部分离的菌株CHR2-1对测试的8种靶标真菌均表现出优异的广谱拮抗活性，抑菌率均超过50%，其中对香蕉枯萎病菌Foc的抑菌率高达88.40%，对多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）的抑菌率也达到82.02%。基于其广谱且高效的拮抗活性，选择CHR2-1进行后续研究。
3.2 内生细菌CHR2-1的鉴定
菌株CHR2-1在牛肉膏蛋白胨平板上生长24小时后，菌落平坦、不透明、白色，表面粗糙干燥。革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色结果显示，该菌为革兰氏阳性杆菌，具有中生芽孢和周生鞭毛。生理生化特性（表3）及16S rDNA序列分析（GenBank登录号JX502843）表明，CHR2-1与枯草芽孢杆菌A17（KC434971）序列相似性达100%，结合形态学和生理生化特征，最终将其鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
3.3 CHR2-1对孢子萌发的影响
CHR2-1的LB和NA培养液滤液对5种植物病原真菌的孢子萌发均有抑制作用（表4）。其中，LB培养滤液对尖孢镰刀菌（ATCC 18467）的孢子萌发抑制效果最强，抑制率达77.09%；对香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）和香蕉枯萎病菌Foc的孢子萌发也有较强抑制。而NA培养滤液的抑制活性相对较差。这表明选择适宜的培养基对CHR2-1产生活性物质至关重要。
3.4 CHR2-1防治香蕉枯萎病的盆栽试验结果
盆栽试验表明（表5），施用CHR2-1菌悬液可有效控制香蕉枯萎病的发生。接种病原菌30天后，无菌水处理的对照病情指数高达78.64%，而CHR2-1处理组的病情指数仅为27.04%，防治效果达到65.62%，与化学药剂95%恶霉灵（防治效果61.00%）无显著差异。这证明CHR2-1菌株具有与化学药剂相当的田间防病潜力。
3.5 CHR2-1对香蕉幼苗的促生作用
盆栽试验结果显示（表6），施用CHR2-1菌悬液处理45天后，香蕉苗的株高增量、茎粗增量、地上部和地下部鲜重均显著高于LB培养液或无菌水处理组。这表明CHR2-1不仅具有生防功能，还能有效促进香蕉植株的生长，表现出良好的植物促生效果。
3.6 CHR2-1培养条件的优化结果
单因素优化试验（图5）确定了CHR2-1的最适培养条件：温度为33°C，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为硝酸钾（KNO3），最适pH值为7.5。这些条件为后续发酵优化奠定了基础。
3.7 CHR2-1发酵条件的优化结果
3.7.1 数学模型的建立与显著性检验
基于二次通用旋转组合设计的试验结果（表7），通过回归分析建立了以抑菌圈直径为响应值（y），蛋白胨（x1）、蔗糖（x2）、硝酸钾（x3）、氯化钠（x4）添加量为自变量的二次多项式回归模型。方差分析（表8）表明，回归模型极显著，失拟性不显著，模型拟合良好。对各因子效应分析（表9， 图6）发现，在试验范围内，各因素与抑菌效果呈开口向下的抛物线关系。通过主效应分析可知，四个因素对抑菌效果影响的顺序为：蛋白胨 > 蔗糖 > 硝酸钾 > 氯化钠。此外，蛋白胨与蔗糖、蔗糖与硝酸钾等因素之间存在显著的交互作用。
3.7.2 最优发酵条件的确定与验证
通过对回归模型求导和分析，得出CHR2-1产生抑菌物质的最优发酵培养基组成为：蛋白胨 10.42 g/L， 蔗糖 1.04 g/L， 硝酸钾 2.75 g/L， 氯化钠 5.5 g/L。结合培养条件优化结果，最终的优化发酵参数为：温度33°C，初始pH 7.5，摇床转速180 rpm，发酵时间24小时。在此优化条件下，CHR2-1发酵滤液对Foc的抑菌活性得到最大提升。
4 结论
本研究成功从中国特有药用植物海南山柑中分离、筛选到一株具有高效、广谱拮抗活性的内生细菌CHR2-1，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株不仅能显著抑制包括香蕉枯萎病在内的多种植物病原真菌，还能有效促进香蕉幼苗生长，集“生防”与“促生”功能于一体，展现出作为多功能生物制剂的巨大潜力。盆栽试验证明，其对香蕉枯萎病的防治效果与化学药剂相当。此外，通过响应面法系统优化了其发酵条件，为后续规模化生产和应用奠定了基础。该研究为发掘新型、高效的植物内生菌资源，开发环境友好的生物农药以替代化学农药，实现农业的绿色可持续发展提供了新的思路和菌种资源。
