《Frontiers in Immunology》：CPEB1 drives ferroptosis–neuroinflammation crosstalk in temporal lobe epilepsy via the SIRT1–NRF2 acetylation axis
编辑推荐：
本研究发现，胞质多聚腺苷酸元件结合蛋白1（CPEB1）是颞叶癫痫（TLE）神经元损伤的关键驱动因子。CPEB1在TLE患者和模型小鼠的神经元中显著上调，通过抑制SIRT1活性，增强NRF2的乙酰化依赖的降解，损害下游SLC7A11/GPX4抗氧化信号，从而加剧神经炎症和铁死亡。该研究揭示了CPEB1-SIRT1-NRF2乙酰化轴是连接铁死亡与神经炎症的关键桥梁，为药物难治性癫痫提供了新的潜在治疗靶点。
引言
癫痫是全球最常见的慢性神经系统疾病之一，其中颞叶癫痫（Temporal Lobe Epilepsy, TLE）是最常见且对药物抵抗的亚型。TLE的病理特征包括海马硬化、异常突触重塑和进行性神经元丢失。传统上，细胞凋亡和自噬被视为癫痫相关神经元损伤的主要机制，但近年研究证据表明，铁死亡（ferroptosis）——一种由致命的脂质过氧化驱动的铁依赖性调节性细胞死亡——在其中扮演了关键致病角色。铁死亡是神经系统疾病中的一个关键病理过程。在癫痫中，癫痫发作可提高大脑中的Fe2+水平，促进活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累，并抑制抗氧化防御系统。同时，神经炎症同样是癫痫发生的普遍驱动因素。癫痫发作可触发激活的小胶质细胞和星形胶质细胞释放促炎细胞因子（如IL-1β, IL-6, TNF-α），破坏血脑屏障，加剧神经元兴奋性。重要的是，铁死亡和神经炎症并非孤立事件，它们通过氧化应激在机制上相互耦合，形成恶性循环，持续加剧脑损伤。然而，在转录后水平上调控这两个致死过程“对话”的上游分子“开关”在很大程度上仍然未知。
胞质多聚腺苷酸元件结合蛋白1（Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 1, CPEB1）是CPEB蛋白家族的核心成员，在神经系统中广泛表达，在神经可塑性、突触发生以及学习记忆等高级过程中扮演着关键角色。然而，CPEB1在癫痫发病机制，特别是TLE中的直接作用证据仍然缺乏。本研究通过整合单细胞转录组学和bulk RNA测序分析，发现CPEB1是TLE病理进展中的一个关键调节分子。
材料与方法
本研究整合了多组学策略，包括对TLE患者的单细胞转录组学、bulk RNA测序和生物信息学分析，并在人癫痫海马组织、海人藻酸（kainic acid, KA）和戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）诱导的小鼠模型以及体外谷氨酸诱导的神经元损伤模型中进行验证。机制研究使用了腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的CPEB1过表达和敲低，以及SIRT1和NRF2通路的药理学调节。人类脑组织样本来自哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科。动物实验使用了C57BL/6J雄性小鼠，建立了KA和PTZ诱导的慢性癫痫模型。AAV病毒被注射到小鼠双侧海马CA1区，以实现CPEB1的过表达（ad-CPEB1）或敲低（sh-CPEB1）。检测方法包括蛋白质印迹法（Western Blotting）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、RNA免疫沉淀（RIP）实验、免疫荧光染色、尼氏（Nissl）染色、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等。统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件。
结果
单细胞转录组学揭示TLE神经元中差异表达基因和功能重编程
通过对TLE患者的单细胞转录组数据集（GSE190452）分析，从人类海马组织样本中识别出6种主要细胞类型：神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和少突胶质前体细胞。聚焦于神经元，发现了175个在TLE神经元中的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。KEGG通路富集分析显示，这些DEGs在钙信号、胆碱能突触、谷氨酸能突触和GABA能突触等神经递质相关通路中显著富集。GO功能富集分析进一步表明，在“生物过程”中，DEGs参与神经元发育、神经发生和突触信号传导；在“细胞成分”中，它们富集于神经元和突触结构；在“分子功能”中，它们主要与离子通道活性和跨膜离子转运相关。
多组学整合分析确定CPEB1为参与铁死亡的关键候选基因
对bulk RNA-seq数据集（GSE256068）的分析鉴定出1919个DEGs。将这些DEGs与GeneCards数据库中的癫痫相关基因以及单细胞分析中发现的神经元特异性DEGs取交集，最终得到13个与TLE神经元高度相关的核心DEGs。这13个基因主要参与关键的生物过程，包括神经元结构组织、蛋白去乙酰化和细胞氧化应激反应。为了进一步识别与铁死亡相关的候选分子，将这13个核心基因与FerrDb数据库中的铁死亡相关基因取交集，最终突出了两个潜在的关键调节因子：CPEB1和SIRT1。CPEB1在胰腺癌和胃癌中已被报道参与铁死亡，但其在TLE神经元铁死亡中的作用和机制尚不清楚。因此，CPEB1被确定为本研究的核心焦点。
TLE脑中CPEB1的表达和分布
在TLE患者的海马和皮质组织中，CPEB1蛋白水平与非癫痫对照组相比显著升高。在KA诱导的癫痫模型和PTZ点燃模型中，CPEB1在海马和皮质组织中的表达也均显著上调。免疫荧光染色显示，在人类TLE样本和癫痫小鼠模型中，CPEB1与神经元标记物NeuN显著共定位，主要位于神经元胞体中。相反，CPEB1与星形胶质细胞标记物GFAP或小胶质细胞标记物Iba1的共定位极少。这表明CPEB1的上调主要在神经元中富集。
CPEB1增加癫痫持续状态后的癫痫易感性和神经元死亡
通过AAV介导的策略，在小鼠双侧海马CA1区建立了CPEB1过表达和敲低模型。在PTZ诱导的慢性癫痫模型中，与sh-NC对照组相比，sh-CPEB1组小鼠表现出显著降低的癫痫发作评分、缩短的全身强直-阵挛发作（Generalized Tonic–Clonic Seizure, GTC）持续时间以及延长的发作潜伏期，表明其癫痫易感性降低。相反，ad-CPEB1小鼠相对于ad-NC对照组，表现出显著升高的癫痫发作评分和延长的GTC持续时间。在KA诱导的癫痫模型中进行组织学分析，尼氏染色显示，CPEB1过表达导致海马CA1和CA3区明显的神经元丢失和细胞结构破坏，而sh-CPEB1干预则显著保留了这些区域的神经元形态并减少了神经元丢失。乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）检测也证实，ad-CPEB1小鼠海马和皮质组织中的LDH水平显著升高，而sh-CPEB1小鼠则显著降低。这些结果表明，CPEB1在癫痫模型中发挥促癫痫发生和神经毒性作用。
CPEB1敲低减轻神经炎症和神经元铁死亡
在KA诱导的癫痫模型中，ELISA检测促炎细胞因子水平。结果显示，与ad-NC组相比，ad-CPEB1组海马和皮质中白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）水平显著升高。相反，与sh-NC组相比，sh-CPEB1组中这些细胞因子水平显著降低。这表明CPEB1通过促进促炎细胞因子的释放加剧神经元损伤。此外，研究还发现CPEB1在铁死亡中发挥作用。与ad-NC组相比，ad-CPEB1组海马和皮质中丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、亚铁离子（Fe2+）和活性氧（ROS）水平显著升高，同时谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性显著降低。相比之下，与sh-NC组相比，sh-CPEB1组表现出MDA、Fe2+和ROS水平降低，以及GSH含量和SOD活性增加。蛋白质印迹分析显示，sh-CPEB1组海马和皮质中关键的铁死亡抑制蛋白SLC7A11和GPX4的水平显著上调，而ad-CPEB1组则显著下调。透射电镜观察显示，ad-CPEB1组神经元表现出典型的铁死亡特征，包括线粒体收缩、嵴减少和膜密度增加，而sh-CPEB1组神经元的线粒体形态则相对保存完好。总之，CPEB1通过抑制SLC7A11/GPX4通路，加剧神经炎症并诱导神经元铁死亡。
CPEB1促进NRF2降解，从而促进神经炎症并抑制下游抗铁死亡因子
SLC7A11的表达受p53、NRF2和BAP-1等多个上游因子调控。蛋白质印迹分析发现，在KA模型小鼠的海马和皮质中，ad-CPEB1和sh-CPEB1干预显著改变了NRF2蛋白水平，而对p53或BAP-1没有显著影响。在HT22细胞中进行的环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）追踪实验表明，CPEB1过表达显著加速了NRF2的降解，将其半衰期从对照组的约30分钟缩短至10分钟。qRT-PCR分析显示，尽管蛋白质印迹检测到NRF2蛋白丰度发生显著变化，但各组间NRF2的mRNA（NFE2L2）表达无显著差异，这表明CPEB1主要在翻译后水平调节NRF2的稳定性。为了研究NRF2的作用，在sh-CPEB1干预的KA模型小鼠中使用了NRF2特异性抑制剂ML385。ELISA分析显示，与sh-CPEB1组相比，sh-CPEB1+ML385组海马和皮质中IL-1β、IL-6、TNF-α和LDH水平显著升高。在铁死亡相关标志物方面，sh-CPEB1+ML385组表现出MDA和Fe2+水平升高，同时GSH含量和SOD活性降低。蛋白质印迹分析进一步表明，ML385逆转了sh-CPEB1引起的SLC7A11和GPX4的上调。DHE荧光染色显示，ML385处理显著增加了海马CA1、CA3区及皮质中的ROS水平。透射电镜证实，ML385处理加重了海马和皮质神经元的线粒体收缩和结构损伤。
CPEB1通过负向调节SIRT1/NRF2信号轴加剧神经炎症和神经元铁死亡
NRF2蛋白的稳定性受其乙酰化修饰调控。蛋白质印迹分析显示，sh-CPEB1显著降低了KA模型小鼠海马和皮质中NRF2 Lys599位点的乙酰化水平，而ad-CPEB1则显著增强了该位点的乙酰化。这提示CPEB1通过促进NRF2乙酰化来降低其稳定性。生物信息学分析确定SIRT1是与TLE神经元铁死亡密切相关的候选分子。已知SIRT1激活可以使NRF2去乙酰化，增强其稳定性和活性。分子对接（使用HDOCK）显示，CPEB1的RRM结构域与SIRT1 mRNA的3‘非翻译区（3’ Untranslated Region, 3‘UTR）之间存在很强的结构互补性。RNA免疫沉淀实验证实，抗CPEB1抗体可显著富集海马和皮质组织中的SIRT1 mRNA，且KA诱导的癫痫组中SIRT1 mRNA与CPEB1的结合水平显著高于对照组。蛋白质印迹分析表明，sh-CPEB1显著上调了癫痫小鼠海马和皮质中SIRT1的水平，而ad-CPEB1则导致SIRT1表达降低。为了进一步验证SIRT1的作用，在sh-CPEB1干预的KA模型小鼠中使用了SIRT1抑制剂EX-527。与sh-CPEB1组相比，sh-CPEB1+EX-527组海马和皮质中促炎细胞因子、LDH、MDA、Fe2+和ROS水平显著升高，而GSH含量、SOD活性以及SLC7A11和GPX4蛋白表达显著降低。透射电镜显示，EX-527处理加重了线粒体损伤。
结论
CPEB1是TLE中连接神经炎症和铁死亡的关键分子节点。在TLE中，CPEB1在神经元中显著上调。CPEB1通过其RRM结构域与SIRT1 mRNA的3‘UTR结合，负向调控SIRT1的表达。SIRT1水平的降低导致其对NRF2的去乙酰化能力减弱，使得NRF2在Lys599位点的乙酰化水平增加。乙酰化的NRF2稳定性下降，被加速降解。NRF2蛋白的减少削弱了其转录活性，导致其下游靶基因SLC7A11和GPX4的表达下调。SLC7A11/GPX4通路的抑制破坏了细胞的抗氧化防御体系，导致ROS积累、脂质过氧化和铁死亡发生。同时，NRF2的缺失和氧化应激的加剧也促进了促炎细胞因子的释放，放大神经炎症反应。而神经炎症又进一步加剧氧化应激，形成铁死亡-神经炎症的恶性循环，最终导致癫痫相关的神经元损伤和丢失。靶向CPEB1-SIRT1-NRF2乙酰化轴，可能为治疗药物难治性癫痫及相关神经退行性疾病提供一种有前景的治疗策略。
