《Biotechnology for the Environment》：Automated assays accelerate bioprocess development for the production of peroxidases in Komagataella phaffii
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为解决不饱和聚酯树脂固化过程中钴基催干剂带来的健康与环境风险，研究人员针对毕赤酵母（Komagataella phaffii）生产过氧化物酶的工艺，成功将ABTS过氧化物酶活性测定与Bradford总蛋白浓度测定整合为全自动化工作流程。该方案显著提高了分析精度与操作员脱手时间，为实现酶法替代钴催化剂的高通量菌株筛选与工艺优化提供了强有力的分析工具。
想象一下，风力涡轮机的叶片、游艇的船体，这些由不饱和聚酯树脂制成的复合材料在我们的工业和生活中无处不在。它们的硬化过程，通常依赖于一种名为钴的金属作为“催化干剂”来启动反应。然而，钴的“阴暗面”正逐渐显露：它不仅被归类为潜在致癌物，其开采过程也伴随着恶劣的工作环境，加之其在可充电电池、超级合金等领域的巨大需求，使得这种有限资源的价格飙升，供应链也面临压力。更可持续、更安全的替代方案迫在眉睫。
自然界中的酶，以其高效、专一和可生物降解的特性，成为了替代化学催化剂的理想候选者。其中，过氧化物酶（Peroxidase）因其能够催化与钴基催化剂相同的树脂固化反应而备受关注。为了实现这种酶的大规模工业生产，科学家们将目光投向了毕赤酵母（Komagataella phaffii）。这种甲基营养型酵母是生产异源蛋白的“明星工厂”，能够高效地将目标蛋白分泌到培养液中，极大简化了下游纯化步骤。但是，要找到最优的生产菌株和最佳培养条件，需要进行海量的培养实验和样品分析。传统手动分析不仅耗时费力，还容易引入人为误差，成为制约工艺开发速度的瓶颈。
为此，一项发表在《Biotechnology for the Environment》上的研究，致力于为毕赤酵母生产过氧化物酶的生物工艺开发打造一个“自动化分析引擎”。研究人员成功地将过氧化物酶活性测定的ABTS法和总蛋白浓度测定的Bradford法整合到一个全自动化的机器人液体处理工作流程中。他们不仅优化了移液方案和测量程序，还解决了自动化过程中出现的微孔板位置偏差和标准曲线非线性等具体问题。最终，这一自动化方案将整个分析流程的操作员脱手时间从41%大幅提升至92%，意味着研究人员只需进行初始设置，随后便可“放手”让机器自动完成大量样品的分析，甚至可以安排在夜间或周末运行。更为重要的是，自动化后的ABTS测定其平均相对标准偏差从18%降至7%，分析精度的显著提升为菌株筛选和工艺优化的决策提供了更可靠的数据支撑。这项研究为加速开发用于替代钴基催化干剂的过氧化物酶生物生产工艺，迈出了关键一步。
为开展研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，利用毕赤酵母（Komagataella phaffii）作为宿主，表达来自Hypoxylon sp. EC38的非特异性过氧合酶（HspUPO），并通过甘油阻遏诱导的PDF启动子调控表达。其次，在1.7 L搅拌罐生物反应器中进行四平行补料分批培养，以生产目标酶。最后，也是本研究的核心，即在使用TECAN Freedom Evo200自动化液体处理平台的基础上，对培养上清液样品进行全自动化的ABTS过氧化物酶活性测定和Bradford总蛋白浓度测定，并对自动化流程进行了系统优化与验证。
工作流程概述：ABTS和Bradford测定的自动化
研究构建了一个完整的生物工艺开发与分析工作流程。从冷冻菌种接种摇瓶预培养开始，进而接种至四个平行的搅拌罐生物反应器进行主培养。定期取样、离心后，细胞沉淀用于测定细胞干重，而上清液则用于自动化分析。分析工作流包含多个稀释和液体处理步骤：上清液被分别稀释5倍（用于Bradford测定）和100倍（用于ABTS测定）。Bradford测定将稀释样品与考马斯亮蓝G-250染料混合，孵育后测定595 nm处吸光度，通过牛血清白蛋白（BSA）标准曲线计算总蛋白浓度。ABTS测定则将稀释样品与含有ABTS和过氧化氢的底物溶液混合，在405 nm波长下连续监测吸光度变化约10分钟，以此计算过氧化物酶活性。为了解决ABTS反应的动力学特性与酶标仪逐孔测量速度之间的矛盾，样品被分成三批依次启动反应和测量。整个自动化流程可在约3.5小时内完成48个样品双复孔的分析，且无需人员值守。
ABTS测定自动化中的位置偏差
在自动化初期，研究人员发现微孔板上存在明显的左右半区信号差异，右侧吸光度比左侧平均高约40%。通过深入排查，他们将问题根源锁定在液体处理系统的“多通道分液”操作上。该操作先吸取较大体积样品，然后分多次、小体积加入不同孔中。推测在第一次分液时，针头内用于隔离系统液和样品的“尾部气隙”可能影响了实际分液体积。通过调整程序，丢弃第一次（可能不准确）的分液步骤，仅使用后续分液步骤，成功消除了位置偏差，使整板96个复孔样品的信号趋于一致，相对标准偏差约为7%。
Bradford自动化中的非线性进展
在自动化Bradford测定时，研究人员观察到BSA标准品浓度与595 nm吸光度之间在高于约0.75 g*L-1时呈现非线性关系。这意味着，如果样品中蛋白浓度过高，使用线性回归计算会得到不准确的结果。因此，他们确定样品至少需要稀释5倍，以确保其蛋白浓度落在标准曲线的线性范围内。研究建立的自动化脚本可以灵活适应不同稀释度的需求，以应对样品蛋白浓度未知或差异较大的情况。
应用研究：手动与自动化样品分析的比较
为了验证自动化方法的准确性与稳健性，研究人员对四平行生物反应器培养的样品同时进行了手动和自动化分析。细胞干重数据显示了典型的生长与生产两阶段过程：前40小时为生物量生产期，细胞干重升至约80 gL-1；随后进入为期24小时的甘油限制性补料（解阻遏）生产期，生物量增长停滞，而过氧化物酶活性和总蛋白浓度持续上升。对比发现，自动化ABTS测定得到的过氧化物酶活性值普遍高于手动测定（例如，终点值范围分别为2.8-3.8 UmL-1和2.0-2.9 U*mL-1），且平均相对标准偏差从手动时的16.8%显著改善至8.0%，显示了自动化在提高精密度方面的优势。自动化Bradford测定的蛋白浓度值也高于手动测定，但其平均相对标准偏差从手动时的8.3%上升至18.2%。分析表明，这可能是由孔内气泡、微孔板材质误差等导致的个别离群值引起，而非整个流程的系统性不准确。尽管如此，自动化Bradford测定同样受益于极高的操作员脱手时间。进一步分析数据发现，过氧化物酶活性高并不总与总蛋白浓度高直接对应，这凸显了同时测定活性与浓度对于全面评估菌株分泌效率和产物比活的重要性。
研究结论与讨论
本研究成功实现了毕赤酵母过氧化物酶生产生物工艺中关键分析流程（ABTS活性测定与Bradford蛋白定量）的全自动化。通过优化移液方案、测量批次和样品稀释策略，自动化ABTS测定的精密度得到显著提升（相对标准偏差从16.8%降至8.0%），而自动化Bradford测定虽在精密度上未超越手动法，但两者共同将整个分析流程的操作员脱手时间从41%大幅提升至92%，实现了样品的无人值守、高通量分析。
这项工作的重要意义在于，它为大规模的菌株表型筛选和生物工艺优化扫清了一个关键障碍。在现代高通量微培养技术（如Growth Profiler 960可并行进行数百个培养）能够产生海量样品的背景下，高效、可靠的分析能力成为瓶颈。本研究开发的自动化工作流程恰好与之匹配，能极大减少人工干预，降低开发成本，缩短开发周期。它使得研究人员能够更快速、更精准地评估不同菌株和培养条件下的关键性能指标（如酶活、产量、产率），从而加速寻找最优生产工艺。
最终，这项研究旨在推动利用生物制造的过氧化物酶，在经济可行的规模上替代传统的不饱和聚酯树脂固化工艺中的钴基催化干剂。通过闭合上游培养与下游分析之间的“自动化循环”，该工作为开发更可持续、更安全的工业生产流程奠定了坚实的技术基础，体现了生物技术解决环境与健康挑战的巨大潜力。
