《International Microbiology》：Genomic, metabolomic, and functional properties of probiotic lactic acid bacteria isolated from Indonesian stingless bee honey
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本研究旨在解决从天然功能食品资源中挖掘新型益生菌候选株，以拓展其在食品和营养保健品中的应用。研究人员从七种印尼无刺蜂蜂蜜中分离乳酸菌(LAB)，通过抗菌活性筛选获得5株高活性菌株，进而整合全基因组测序(WGS)、益生特性评估、代谢组学等多组学技术，系统表征了其基因组特征、次级代谢产物基因簇、益生特性、细胞上清(CFS)的抗菌、抗氧化及α-淀粉酶抑制活性。结果表明，这些源于无刺蜂蜂蜜的LAB (Lacticaseibacillus rhamnosus 和 Pediococcus acidilactici) 是兼具优良益生特性与多重生物活性的潜力菌株。该研究为开发功能性食品、生物防腐剂及益生菌制剂提供了新策略和新菌种资源。
提到蜂蜜，人们通常会想到由常见蜜蜂生产的蜂蜜。然而，在热带和亚热带地区，还存在一类特别的蜜蜂——无刺蜂。它们生产的“无刺蜂蜂蜜”(SBH) 在风味、化学成分和生物活性上均不同于普通蜂蜜，被认为是一种具有抗菌、抗氧化、抗炎、神经保护等多种健康益处的功能食品。但除了蜂蜜本身的营养成分，其中定植的微生物群落，特别是乳酸菌(LAB)，对蜂蜜功能特性的贡献及其自身的应用潜力仍是一个有待深入探索的“黑箱”。鉴于现有研究对源自印尼无刺蜂蜂蜜的乳酸菌多样性及其功能认知有限，一个关键的科学问题随之浮现：这些天然生境中的乳酸菌是否蕴藏着独特的益生潜力和生物活性？其背后的遗传和代谢基础又是什么？
为了回答这些问题，以Damayanti E. 等研究人员为首的研究团队展开了一项系统性研究。他们从来自七种印尼本土无刺蜂（如Heterotrigona itama, Tetragonula laeviceps等）的蜂蜜样品中分离乳酸菌，并通过抗菌活性筛选，优选出五株最具潜力的菌株。研究综合运用了全基因组测序(WGS)、基因组挖掘、体外益生特性评估、抗氧化能力测定、α-淀粉酶抑制实验以及非靶向代谢组学(UHPLC-HRMS)等多种技术手段，对菌株进行了多维度的表征。这项研究成果以“Genomic, metabolomic, and functional properties of probiotic lactic acid bacteria isolated from Indonesian stingless bee honey”为题，发表于国际期刊《International Microbiology》。
本研究的关键技术方法主要包括：从七种印尼无刺蜂蜂蜜样本中分离和初步表征乳酸菌；通过微孔板稀释法筛选菌株的抗菌活性；对高活性菌株进行基于牛津纳米孔技术的全基因组测序、组装、注释及基因组挖掘（使用AntiSMASH和BAGEL4）；通过模拟胃肠道（低pH、胃液、胆汁盐）条件评估菌株的益生特性；采用DPPH、ABTS、FRAP等多种体外化学法评估菌株细胞上清(CFS)的抗氧化能力；测定CFS的总酚、总黄酮含量及α-淀粉酶抑制活性；利用超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS)对CFS进行非靶向代谢组学分析。
研究结果
筛选和表征乳酸菌
从七种无刺蜂蜂蜜中分离出32株乳酸菌，并筛选出5株（TB-3, HI-1, TS-4, HI-5, LT-3）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等病原菌具有最高抑制活性的菌株。通过16S rRNA基因测序初步鉴定，TB-3、HI-1和TS-4与Lacticaseibacillus rhamnosus（鼠李糖乳杆菌）高度相似，而HI-5和LT-3与Pediococcus acidilactici（乳酸片球菌）高度相似。扫描电镜(SEM)观察进一步证实了它们的形态特征：L. rhamnosus呈杆状，P. acidilactici呈球状。
全基因组特征
对五株菌进行了全基因组测序。L. rhamnosus菌株（TB-3, TS-4, HI-1）基因组大小约为2.98 Mb，GC含量46.8%，编码约2750个基因。P. acidilactici菌株（HI-5, LT-3）基因组较小，约1.96 Mb，GC含量42.1%，编码约1814个基因。所有菌株均含有CRISPR-Cas系统。功能注释显示，基因主要富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、应激反应和次级代谢物生物合成等通路。
系统基因组学分析
基于全基因组的平均核苷酸一致性(ANI)和数字DNA-DNA杂交(dDDH)分析，进一步确认TB-3、TS-4和HI-1属于L. rhamnosus，而LT-3和HI-5属于P. acidilactici。系统发育树清晰展示了菌株与各自模式菌株的紧密聚类关系。
基因组挖掘分析以预测生物活性化合物
利用AntiSMASH和BAGEL4工具进行基因组挖掘。在三个L. rhamnosus菌株中均鉴定出两个生物合成基因簇(BGC)，一个编码核糖体合成和翻译后修饰肽(RiPP-like)，与凝结素基因簇相似；另一个编码III型聚酮合酶(T3PKS)，与viguipepinol生物合成基因簇相似。此外，BAGEL4预测这些菌株含有属于Carnocin类的细菌素基因簇。在两个P. acidilactici菌株中，HI-5含有一个非核糖体肽合成酶(NRPS)基因簇，与一种氟代代谢物5-FHPA的生物合成基因簇相似；LT-3含有一个T3PKS基因簇。这些基因簇编码的化合物与抗菌、抗氧化等活性相关。
益生特性
所有五株菌在模拟胃肠道胁迫条件下均表现出良好的耐受性。在胆汁盐、模拟胃液和低pH(pH 2)环境中处理数小时后，所有菌株的存活率均保持在50%以上，部分菌株存活率超过70%，显示了其作为益生菌穿越胃肠道的潜力。
乳酸菌细胞上清(CFS)的抗氧化活性测定
通过DPPH、ABTS、FRAP和TEAC多种方法评估了CFS的抗氧化能力。结果显示，不同菌株的抗氧化活性存在差异。例如，P. acidilacticiLT-3和L. rhamnosusHI-1的DPPH自由基清除活性最强(IC50值最低)，而L. rhamnosusTS-4在ABTS和FRAP实验中表现出最强的抗氧化能力。这些结果表明菌株具有显著的、菌株特异性的抗氧化潜力。
乳酸菌细胞上清(CFS)的α-淀粉酶抑制实验
CFS显示出对α-淀粉酶的抑制活性，这是潜在降血糖功能的指标。其中，两株P. acidilactici(LT-3和HI-5)的抑制活性最高(约57%)，显著高于三株L. rhamnosus菌株(约23-26%)。这是首次报道源自无刺蜂蜂蜜的乳酸菌具有α-淀粉酶抑制活性。
总酚含量(TPC)和总黄酮含量(TFC)测定及抗菌活性
CFS中含有丰富的多酚和黄酮类化合物。其中L. rhamnosusTS-4和HI-1的总酚含量最高，而L. rhamnosusTB-3的总黄酮含量最高。这些化合物可能贡献于其抗氧化活性。在抗菌活性方面，P. acidilacticiLT-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和混合菌群的抑制能力最强，而L. rhamnosusTB-3对铜绿假单胞菌的抑制效果最佳，体现了菌株特异的抗菌谱。
代谢组学分析
通过UHPLC-HRMS对CFS进行的非靶向代谢组学分析，揭示了五株菌独特的代谢物谱，并鉴定出若干潜在的生物活性化合物，为进一步阐明其功能机制提供了线索。
研究结论与意义
本研究首次系统报道了从多种印尼本土无刺蜂蜂蜜中分离的乳酸菌，整合基因组学、代谢组学和体外功能分析，全面揭示了其作为益生菌候选株的巨大潜力。主要结论如下：
- 1.
成功分离与鉴定：从七种无刺蜂蜂蜜中筛选出五株高抗菌活性的乳酸菌，经全基因组分析精确鉴定为三株Lacticaseibacillus rhamnosus(TB-3, HI-1, TS-4) 和两株Pediococcus acidilactici(HI-5, LT-3)。
- 2.
揭示遗传基础：全基因组测序和注释揭示了菌株的基因组特征。关键的发现是通过基因组挖掘鉴定出多种生物合成基因簇(BGC)，包括与细菌素(如Carnocin类、凝结素类似物)、聚酮化合物(如T3PKS)和非核糖体肽(NRPS)相关的基因簇。这些基因簇为其抗菌、抗氧化等生物活性提供了潜在的遗传解释。
- 3.
证实益生潜力：所有菌株在模拟胃肠道胁迫(低pH、胃蛋白酶、胆汁盐)下均表现出高存活率，满足益生菌的基本要求。
- 4.
阐明多功能生物活性：菌株的细胞上清(CFS)具有广谱且强效的抗菌活性、显著的抗氧化能力（通过DPPH、ABTS、FRAP等多种方法证实）、高含量的多酚与黄酮类物质，以及首次在此类菌中报道的α-淀粉酶抑制活性。这些功能特性具有菌株特异性。
- 5.
关联表型与基因型：研究将观察到的抗菌、抗氧化等表型与基因组中预测的次级代谢产物合成潜能相关联，例如将L. rhamnosus的活性与其RiPP-like (凝结素类似物)和T3PKS (viguipepinol类似物)基因簇相联系。
本研究的意义深远。首先，它拓展了益生菌和生物活性化合物的天然资源库，将无刺蜂蜂蜜这一独特生态位确立为新型功能微生物的宝贵来源。其次，研究采用的“基因组-代谢组-表型”整合分析策略，为深度挖掘和理性开发微生物资源提供了范本。最后，这些兼具优良益生特性、抗菌、抗氧化及潜在降血糖（α-淀粉酶抑制）活性的乳酸菌，在功能性食品、膳食补充剂、天然生物防腐剂乃至具有特定健康宣称的益生菌制剂开发方面，展现出巨大的应用前景。该工作为未来利用合成生物学或代谢工程手段优化菌株、解析活性物质和作用机制奠定了坚实基础。
