《International Microbiology》：Technological potential of Bacillus megaterium in Cacao bean fermentation
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为改善高涩味、苦味且易受真菌毒素污染的CCN51基因型可可豆的品质，本研究从本土发酵可可豆中分离筛选芽孢杆菌（Bacillusspp.）并评估其作为发酵剂的效果。结果表明，B. megaterium分离株GHAA2R3T1可显著提升可可豆的发酵指数（最高达1.5），降低发酵不足豆比例，改善感官品质（突出花香、果香、坚果香与蔗糖-麦芽香），并对产毒真菌展现抗真菌活性。该研究证实芽孢杆菌具有作为发酵剂提升可可豆加工安全与风味的生物技术潜力。
巧克力那令人无法抗拒的香气与丝滑口感，很大程度上始于可可豆的发酵。在发酵箱中，多种微生物如同一个精密的交响乐团，共同将原始的豆子转化为风味丰富的基础原料。酵母、乳酸菌、醋酸菌的作用已被广泛认知，但其中一类重要的“乐手”——芽孢杆菌（Bacillus），其具体贡献和潜力却相对模糊。特别是对于CCN51这一高产、抗病，但因其高涩味和苦味而市场接受度不佳的可可豆基因型，如何通过优化发酵过程来提升其品质，是产业面临的一大挑战。此外，不当的发酵条件还会导致产毒真菌（如Aspergillus和 Penicillium）滋生，产生黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A，威胁食品安全。为了探究芽孢杆菌在解决这些问题上的价值，研究人员开展了一项针对性研究，旨在从天然可可发酵物中分离筛选芽孢杆菌，并评估其作为发酵剂对CCN51可可豆发酵过程、感官品质及安全性的影响。该研究成果发表在《International Microbiology》上。
为了开展研究，作者主要采用了以下几个关键技术方法：研究材料来自哥伦比亚托利马地区的传统可可发酵过程。首先，通过菌株分离和多种生物学活性测定（包括生长性能、果胶酶、蛋白酶、柠檬酸裂解酶的产生以及抗真菌活性）筛选芽孢杆菌分离株。随后，将优选分离株制备成发酵剂，在实验室控制的“微发酵”和模拟生产的“宏发酵”两种规模下，评估其对CCN51可可豆的发酵效果。发酵过程中，通过监控温度、pH、总酸度、发酵指数（Fermentation Index, FI）和剖切测试（cut test）来评估物理化学变化，并最终由专业感官评价小组对制成的可可液进行风味剖面分析。
研究结果
Selection of Bacillus isolates to improve the quality and safety of cacao beans（筛选用于提升可可豆品质与安全性的芽孢杆菌分离株）
从哥伦比亚的发酵过程中获得了12个芽孢杆菌分离株。通过在高糖（10%葡萄糖）、高乙醇（5%乙醇）和高温（50°C）胁迫下的生长测试，筛选出耐受性强的菌株。分离株GTBM4.67在各项生长测试中表现突出。后续的酶活测试表明，所有分离株均能产生果胶酶、蛋白酶，并具有柠檬酸利用能力。
Characterization of Bacillus isolates（芽孢杆菌分离株的表征）
所有分离株在Simmons柠檬酸盐培养基上均呈阳性（颜色由绿变蓝），表明具有柠檬酸裂解酶活性。在50%可可果肉琼脂上均形成透明水解圈，证实了果胶酶（pectinase）的分泌。在酪蛋白琼脂上形成透明圈，证实了蛋白酶活性。
Evaluation of the antifungal effect of Bacillus crude extracts on the mycelial growth of mycotoxin-producing fungi（评估芽孢杆菌粗提物对产霉菌毒素真菌菌丝生长的抗真菌效果）
评估了5个分离株的粗提物对Aspergillusspp. 2菌株的抑制作用。在25%浓度下，抑制率在32%至48%之间。其中分离株GTBM7.101和GHAA2R3T1的抑制效果最高，分别达到44%和48%，并且其粗提物中的蛋白质浓度也最高。
Molecular identification of the isolates selected for the microbiological starter（用于微生物发酵剂的分离株的分子鉴定）
通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，确认了分离株的种属。结果显示，分离株GHAA2R3T1为Bacillus megaterium（巨大芽孢杆菌），而其他多个分离株为Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）。
Evaluation of the physical and chemical variables on micro-fermentation（微发酵过程中的物理化学变量评估）
在微发酵实验中，接种了5个优选分离株。发酵过程中pH逐渐下降。在发酵168小时时，分离株GHAA2RR3T1和GHALE2R2T2-2的发酵指数（FI）最高，达到1.5。剖切测试表明，对照组的发酵不足豆比例为36%，而接种GHAA2R3T1和GTBM4.67的处理组分别降至20%和13%。
Sensory profile（感官剖面）
感官分析显示，接种B. megateriumGHAA2R3T1的处理组，其可可风味强度最高（4.8分），而苦味和涩味最低（分别为0.9和1.5分）。该处理组是唯一产生微弱坚果风味的。
Evaluation of the physical and chemical variables on macro-fermentation（宏发酵过程中的物理化学变量评估）
在更大规模的宏发酵中，结果与微发酵一致。接种GHAA2R3T1的处理组在168小时时pH最低（4.1），总酸度最高（0.93%），发酵指数最高（1.5），并且发酵不足豆的比例显著低于对照组。
Sensory profile（感官剖面）（宏发酵）
宏发酵的感官分析进一步确认，接种GHAA2R3T1的可可液，其酸味、果味和坚果味均比对照组更突出，整体更受品评小组偏爱。
归纳研究结论和讨论
本研究表明，在CCN51可可豆的发酵过程中引入特定的芽孢杆菌分离株，特别是B. megateriumGHAA2R3T1，可以有效改善发酵过程和最终产品的品质。其积极作用主要体现在三个方面：提升发酵效率，表现为更高的发酵指数和显著降低的发酵不足豆比例；优化感官品质，在保留可可本味的同时，有效降低其固有的苦味和涩味，并能够突出如花香、果香、坚果香和蔗糖-麦芽香等令人愉悦的次要风味，从而改善了CCN51基因型不佳的感官形象；增强生物安全性，该菌株的代谢产物对产霉菌毒素的Aspergillusspp. 具有一定的抑制活性，为从源头控制真菌毒素污染提供了潜在的生物防治策略。
讨论部分深入分析了其作用机理。芽孢杆菌能够耐受发酵后期的高温和高乙醇环境，并分泌果胶酶和蛋白酶。果胶酶有助于降解果肉，促进发酵均一；蛋白酶则能水解豆内蛋白质，释放出风味前体物质（如苯丙氨酸），这些前体物质在后续加工中转化为巧克力风味的关键成分。此外，芽孢杆菌代谢柠檬酸的能力，可能关联到丁酮、苯乙醇等香气化合物的生成，这些化合物贡献了黄油、坚果和甜香气息。尽管其抗真菌活性的具体机制和强度有待进一步研究，但初步结果令人鼓舞。
综上所述，这项来自哥伦比亚的研究首次系统评估了芽孢杆菌作为可可发酵剂的潜力，证实了B. megaterium在提升CCN51可可豆的感官品质与发酵安全性方面具有明确的生物技术价值。该研究不仅为改善特定可可品种的市场接受度提供了可行的微生物解决方案，也为开发更稳定、更安全、风味更优的可可发酵剂开辟了新的方向。未来研究需对候选菌株进行全面的食品安全评估（如GRAS认证所需的研究），以推动其走向工业化应用。
